DAPI（4」、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）は、蛍光特性により染料として機能する広く、とりわけ、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーの分野で使用されるマーカー。それが発する蛍光は明るい青色で、その励起は455-461 nm（UV光）の間で起こります。
DAPI色素は死細胞の細胞膜を非常に簡単に通過できます。また、生細胞の核を染色する可能性がありますが、この場合、これの濃度を高くする必要があります。
蛍光色素DAPIの化学構造。ソース：画像：ファイル：DAPI.svgは、このファイルのベクターバージョンです。劣っていない場合は、このラスター画像の代わりに使用する必要があります/ Richard Wheeler（Zephyris）編集済み画像
この色素は、特別な親和性を持つ細胞DNAにアクセスすることができ、窒素含有塩基のアデニンおよびチミンに結合します。このため、一部の分子生物学の手法では非常に役立ちます。
この化合物はインドール色素のグループに属しており、特にアガロースゲルでは、臭化エチジウムやヨウ化プロピジウムよりもDNAに対する感度が高いことが示されています。
この蛍光色素の用途は非常に広く、次の用途に役立ちます。アポトーシスプロセス（細胞死）におけるDNAの変化の研究、したがってこのプロセスでの細胞の検出。DNA写真のフットプリント（DNA写真の印刷）; 細菌汚染を研究する; または核のセグメンテーションを視覚化する。
また、染色体バンドの研究、マイコプラズマsp DNAの検出、DNAタンパク質相互作用、免疫蛍光法による細胞の染色と計数、さらには成熟した花粉の着色にも使用されています。
特徴
DAPIは、その化学名の略称です（4 '、6-diamidino-2-phenylindole）。その分子式はC 16 H 15 N 5です。分子量は350.3です。UV光の範囲（345〜358 nm）の近くでは、DAPI-DNA複合体の最大励起が発生し、最大蛍光発光は455-461 nmで発生します。
この染料は黄色の粉末として特徴付けられますが、このフルオロフォアでマークされた構造は、鮮やかな青色の光を発します。
これは水溶性の化合物ですが、溶解を促進するために熱を加えることができます。PBSで希釈できますが、直接溶解することはできません。
色素が準備されたら、2〜8°Cの温度（冷蔵庫）で、暗所、つまり光から保護して保存する必要があります。これらの条件下では、染料は3週間または数か月以上安定です。
光から保護されているが室温で放置された場合、安定性は2〜3週間に低下しますが、直接光にさらされた場合、劣化は非常に速くなります。長期間保存する場合は、-20°Cで冷蔵して、分注して配布できます。
基礎
この染色は、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、中期染色体または間期核などの染色など、主要な分子生物学技術で核対比染色を生成することに基づいています。
この技術は、マイナーグルーブの遺伝物質（DNA）に含まれる窒素含有塩基（アデニンおよびチミン）に対する染料の優れた親和性に基づいています。細胞質レベルにある間、それはほとんどバックグラウンドを残しません。
蛍光色素がDNAのアデニンおよびチミン領域に結合すると、蛍光が大幅に増加します（20倍以上）。それが発する色は明るい青です。特に、GC（グアニン-シトシン）塩基対に結合する場合、蛍光発光はありません。
RNAにも親和性がありますが、これは問題を引き起こしません。この分子からの最高レベルのエネルギー放出は、460でそうするDNAとは異なり、別の波長（500 nm）で発生するためです。 nm。さらに、RNAに結合した後の蛍光の増加はわずか20％です。
死んだ（固定）細胞を染色するには、生きた細胞よりもはるかに高濃度の色素が必要であるため、DAPIは生きた細胞の染色に使用されます。これは、生きているときの細胞膜のDAPI透過性がはるかに低いためです。
DAPI色素は、赤と緑のフルオロフォアと組み合わせて使用して、マルチカラーを体験できます。
使用する
DAPI（4 '、6-diamidino-2-phenylindole）は優れたフルオロフォアであるため、さまざまな技術や目的で広く使用されています。以下では、主な手法でのDAPIの使用について説明します。
フローサイトメトリー
1978年に研究者のゴーデ、シューマン、ザンテは、フローサイトメトリー技術のフルオロフォアとしてDAPIを最初に使用および提案しました。DNAへの高い感度と高い蛍光強度により、大きな成功を収めました。
この手法でDAPIを使用すると、細胞周期の研究、細胞の定量化、生細胞と死細胞の染色が可能になります。
エチジウムブロマイド、ヘキストオキサイド、アクリジンオレンジ、ヨウ化プロピジウムなどの他の着色剤もありますが、DAPIは前述のものよりも光安定性が高いため、最も広く使用されているものの1つです。
この手法では、細胞を固定する必要があります。この絶対エタノールまたは4％パラホルムアルデヒドを使用できるためです。サンプルを遠心分離し、上澄みを廃棄し、その後5 mlのPBSバッファーを15分間加えて細胞を水和させます。
時間の経過中に、3 µMの濃度で染色バッファー（BioLegendのFOXP3）を使用してDAPI染色を準備します。
サンプルを遠心分離し、上清を捨て、室温で15分間1 mlのDAPI溶液で覆います。
適切なレーザーを使用して、サンプルをフローサイトメーターに移動します。
フローマイクロフルオロメトリー
DAPIが使用される別の技術は、ミトラマイシンと呼ばれる別のフルオロフォアと一緒にフロー顕微蛍光測定にあります。どちらも葉緑体DNAを個別に定量化するのに役立ちますが、DAPIはT4バクテリオファージ粒子の測定に最適です。
ハイブリダイゼーション
この手法では、基本的に、DAPIの蛍光色素で標識されたDNAプローブを使用します。
サンプルは、二本鎖DNAを変性させ、それを2本の一本鎖に変換するために熱処理を必要とします。その後、目的の配列を持つDAPI標識変性DNAプローブとハイブリダイズします。
その後、洗浄してハイブリダイズしなかったものを除去し、コントラストを使用してDNAを視覚化します。蛍光顕微鏡は、ハイブリダイズしたプローブの観察を可能にします。
この技術は、染色体DNAの特定の配列を検出し、特定の疾患の診断を行うことを目的としています。
これらの細胞分子技術は、核型の研究で詳細を決定するのに非常に役立ちました。たとえば、ヘテロクロマティック領域またはDAPIバンドと呼ばれる、アデノシンとチミンの塩基対の豊富な領域を示しています。
この手法は、植物や動物の染色体やクロマチンの研究、およびヒトの出生前および血液学的病理の診断に広く使用されています。
この手法では、推奨されるDAPI濃度は15分間で150 ng / mlです。
組み立てられたスライドは、2〜8°Cで遮光して保管する必要があります。
免疫蛍光染色
細胞は4％パラホルムアルデヒドで固定されています。他の染色を使用する場合は、DAPIを最後に対比染色として残し、細胞をPBS溶液で15分間覆います。時間の経過中に、最終濃度が300 µMになるようにPBSで希釈してDAPIソリューションを準備します。
次に、過剰なPBSを取り除き、DAPIで5分間覆います。数回洗います。スライドは適切なフィルターの下で蛍光顕微鏡下で観察されます。
安全シート
この化合物は変異原性があるため、取り扱いには注意が必要です。活性炭は、廃棄される水溶液からこの化合物を除去するために使用されます。
この試薬による事故を防ぐために、手袋、ガウン、安全メガネを使用する必要があります。皮膚や粘膜に触れた場合は、十分な水で洗い流してください。
この試薬を口からピペットで移さないでください。ピペットを使用してください。
微生物試薬で試薬を汚染しないでください。これにより、誤った結果がもたらされます。
染色の品質を著しく低下させるため、DAPI染色を推奨以上に希釈しないでください。
試薬を直射日光にさらさないでください。蛍光が低下するため、保温してください。
参考文献
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