カタラーゼ試験：理論的根拠、技術および用途 - 生物学 - 2025

カタラーゼ試験は、それを所有するもの細菌において酵素、カタラーゼの存在を示すために、細菌学研究室で使用される方法です。グラム染色と一緒に、それらは新しく分離された微生物で実行されるべき主要なテストです。これらのテストは、微生物学者が問題の微生物を確実に特定するための手順を案内します。

一般に、チトクロームを含む細菌は酵素カタラーゼを持っています。つまり、好気性および通性嫌気性細菌はそれを持っているはずです。ただし、Streptococcusなどの通性嫌気性微生物であるにもかかわらず、酵素カタラーゼを持たない例外があります。

カタラーゼテストを実行し、陽性反応を示しています。出典：機械可読の著者は提供されていません。名瀬想定（著作権の主張に基づく）。

これが、主にブドウ球菌科とMicrococaceae科（どちらもカタラーゼ陽性）と連鎖球菌科（カタラーゼ陰性）を区別するためにカタラーゼテストが使用される理由です。

同様に、バチルス属（カタラーゼ陽性）は、クロストリジウム属（カタラーゼ陰性）などと区別されます。

基礎

カタラーゼは、ヒドロペルオキシダーゼとして分類される酵素です。これは、それらが基質として過酸化水素（H ₂ O ₂）を使用することを意味します。

それが関与する反応には、電子供与体（還元物質）として機能する元素と電子受容体（酸化物質）として機能する元素が存在するため、酸化還元酵素とも見なされます。

カタラーゼは、4つの三価の鉄原子（Fe ⁺⁺⁺）を持つプロセリック基を含むタンパク質であるため、ホモタンパク質です。第二鉄イオンは反応中に酸化されたままです。

カタラーゼは、細菌の代謝の過程で産生される、細菌に有害な物質を排除する働きがあるため、解毒酵素と言えます。これらの物質の中には過酸化水素があります。

過酸化水素は、好気的に糖の分解から形成されます。このプロセスは次のように行われます。

スーパーオキシドイオン（O ₂ ^-）（フリーラジカル）は、好気性経路によるグルコース同化の最終生成物として形成されます。これは有毒であり、それをガス状酸素と過酸化水素に変換する酵素スーパーオキシドジスムターゼによって除去されます。

過酸化水素は細菌に対しても有毒であり、除去する必要があります。酵素カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解します。

カタラーゼは、アルコール、アルデヒド、酸、芳香族アミン、フェノールなど、過酸化水素以外の基質に作用します。しかし、過酸化水素は、カタラーゼによってメチルおよびエチルアルコールなどの他の毒性化合物を酸化するためにも使用できます。

同様に、カタラーゼは食細胞に存在し、過酸化水素の毒性作用からそれを保護します。

カタラーゼ試験の通常の手法

-スライド方式

材料

3％過酸化水素（10容量）。

顕微鏡スライド

使い捨てのプラスチック製ハンドルまたは木製のつまようじ。

処理する

そこから来た寒天に触れずに研究するのに十分なコロニーを取ります。コロニーは新鮮でなければなりません。つまり、18〜24時間の培養からです。

乾燥したスライドの上にコロニーを置き、それに3％の過酸化水素を1滴加えます（30％のH ₂ O ₂も使用できます）。気泡が放出されるかどうかを直ちに観察します。

解釈

陽性反応：気泡の形成（強い気泡）によって証明されるガスの発生。

ネガティブ反応：泡の形成なし。

-純粋培養での直接法

血液（好ましくは栄養寒天）を含まない純粋なプレートまたはウェッジ培養に1 mlの3％H ₂ O ₂を置きます。すぐに気泡が発生するかどうかを観察します。30％H ₂ O ₂も使用できます。

これは、portaオブジェクトメソッドと同じように解釈されます。

-キャピラリーチューブまたはFungおよびPetrishkoを使用する方法

67 mmのキャピラリーチューブを、毛細管現象によって3％の過酸化水素で20 mmの高さに満たします。

3％H ₂ O _2で満たされたキャピラリーで研究する分離されたコロニーに触れ_ます。キャピラリーが約10秒で気泡で満たされるかどうかを観察します。この方法では、交差反応の半定量化が可能です。

十字架がなければ、気泡はありません（負の反応）。

+ ----気泡がほとんどない（反応が弱い、または反応が遅い）。

++ --–豊富な気泡（中程度の反応）。

+++-泡は反対側の端に到達します（強い反応）。

-疑わしいカタラーゼ試験のためのテイラーとアシャンザー法

分離したコロニーを清潔で乾燥したスライドの上に置き、0.5％H ₂ O ₂を1滴置き、カバースリップで覆います。閉じ込められた気泡の形成があるかどうかを観察します。

解釈：気泡の存在は肯定的な反応を示しています。気泡はありません、それは否定的な反応として解釈されます。

マイコバクテリウム種のカタラーゼ試験

この手法は、pHと温度を制御することによって実行する必要があります。異なるマイコバクテリウム種の操作は危険であるため、層流フードの下で実行する必要があります。

-材料

過酸化水素30％または110ボリューム（スーパーオキサール）。

リン酸緩衝液pH 7

10％トゥイーン80

マイコバクテリウムウェッジ培養3〜4週間

-準備

リン酸緩衝液pH 7

計量する：

1.361 gの無水リン酸一カリウム（KH ₂ PO ₄）。

1.420 gの無水リン酸二ナトリウム（Na2HPO3）。

両方の塩を少し滅菌した蒸留水に溶解し、水で1000 mlにします。

10％トゥイーン80

商業的に濃縮されているTween 80を1:10に希釈します。これを行うには、次の手順に従います。

1 mlのTween 80を少量の蒸留水に入れて溶解し、水で容量を10 mlにします。

最終試薬

一定量のリン酸緩衝液を10％Tween 80と混合します（等量）。ラボで準備する量を定義します。

-処理する

5 mlのリン酸緩衝液を無菌のスクリューキャップ付き試験管（ベークライト）に入れます。

接種ループで、くさびに播種されたマイコバクテリウム増殖の十分なコロニーを取り、リン酸緩衝液に溶解します。

ネジを締めすぎずにチューブにキャップをします。68℃のウォーターバスに20〜30分入れます。取り出して、22-25°Cに冷まします

最終試薬（ミックス）0.5 mlを測定し、冷たい溶液と一緒にチューブに追加します。気泡の形成の有無を観察します。

これは、以前の手法と同じように解釈されます。

使用する

濃縮培地でコロニーの成長が得られたら、得られたコロニーに対してグラム染色とカタラーゼ試験を行う必要があります。これは、微生物学者が最終的な同定を行うための手順を案内します。

出典：著者MScにより作成。マリエルサギル

QA

過酸化水素試薬の優れた性能を評価するには、陽性対照として黄色ブドウ球菌などの培養したての対照株を使用し、陰性対照として連鎖球菌種を使用します。

ポジティブコントロールとして機能する別の方法は、血液寒天に一滴の過酸化水素を置くことです。赤血球はカタラーゼを持っているため、試薬が良好な状態であれば泡立ちます。

チョコレート寒天を陰性対照として使用することができます。ここでは、赤血球はすでに溶解しており、検査は陰性です。

制限事項

-テストに古いカルチャを使用しないでください。これを行うと、偽陰性が発生する可能性があります。

-寒天に触れないように注意する場合は、血液寒天培地からコロニーを採取しないでください。赤血球はカタラーゼを含んでいるので、この手順は偽陽性につながる可能性があります。

-プラチナハンドルでコロニーを採取する場合は、手順を逆にしないでください。これにより、誤検知が発生する可能性があります。これは、プラチナが過酸化水素と反応してバブリングを引き起こす可能性があるためです。

-試薬が非常に不安定であり、時間とともに分解する傾向があるため、試薬が非常に古い場合は、過酸化水素試薬を使用しないでください。

-過酸化水素試薬は光から保護し、損傷を防ぐために冷蔵してください。

・使用する度に過酸化水素試薬の品質管理を行ってください。

-30 ％H ₂ O ₂を使用すると、3％H ₂ O _2を使用した場合よりも反応が強くなることに注意してください。

参考文献

1. Koneman E、Allen S、Janda W、Schreckenberger P、Winn W（2004）。微生物学的診断。第5版 エディトリアルPanamericana SAアルゼンチン。
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