TSI寒天：根拠、準備および使用 - 生物学 - 2025

TSI寒天または三重糖鉄寒天として機能する固体培地であるグラム陰性桿菌の最初の同定を誘導する生化学的試験。これは、存在する糖の発酵、硫化水素とガスの生成を示すことに基づいています。

その組成と基礎は、クリグラー鉄テストに非常に似ていますが、後者にはグルコースとラクトースしか含まれていないという違いがあります。その代わりに、その名前が示すように、三重糖鉄寒天には、グルコース、ラクトース、スクロースという3つの発酵性炭水化物が含まれています。

さまざまな微生物によるTSIテストの画像A. Escherichia coli、B。Shigella flexneri、C）Salmonella typhimurium、D。Pseudomonas aeruginosa。出典：Witmadrid、Wikimedia Commons

さらに、TSI培地には、栄養価の高い寒天になる4つのタンパク質誘導体があります。酵母エキス、肉エキス、ペプトン、プロテオースペプトンです。また、硫酸第一鉄、チオ硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、フェノールレッド、寒天も含まれています。

培地中に存在するグルコースを微生物が発酵できないことは、それを腸内細菌科に属することから直ちに排除する。したがって、このテストは、属と種を決定するためにどの識別ルートを使用するかを決定する上で不可欠です。

各研究所は、TSI寒天とKligler鉄寒天のどちらを使用するかを決定します。

基礎

各化合物は、媒体内で機能を果たします。

塩化ナトリウムと寒天

塩化ナトリウムは、培地の浸透圧バランスを維持するために必要です。寒天はしっかりとした一貫性を与えます。

PHインジケーター（フェノールレッド）

調製した培地のpHは7.3でバランスし、pHインジケーター（フェノールレッド）は6.8未満で黄色になります。これは、糖の発酵によって生成される少量の酸が培地を赤オレンジから黄色に変えることを意味します。

発酵が起こらない場合、ペプトンの使用により培地がアルカリ化され、赤オレンジから濃い赤に変わります。

タンパク質誘導体（酵母エキス、肉エキス、ペプトン、プロテオースペプトン）

細菌がTSI寒天に存在するタンパク質を代謝すると、反応に酸素が必要になるため、培地をアルカリ化するアミン（主にベベルレベル）が生成されます。アミンはベゼルを真っ赤に変えます。

しかし、これはバクテリアが炭水化物を発酵する能力に依存します。

炭水化物（グルコース、ラクトース、スクロース）の発酵

砂糖の発酵の研究はいくつかのイメージを与えることができ、それぞれが異なって解釈されます。テストの解釈では、微生物を3つのカテゴリに分けています。グルコース非発酵菌、ラクトース非発酵菌、ラクトース/スクロース発酵槽です。

培地中のグルコース量は制限されていますが、ラクトースとスクロースの濃度は10倍高いことに注意してください。

腸内細菌科の細菌と他のグルコース発酵微生物は、この糖がエネルギーにとって最も単純な炭水化物であるため、この糖を発酵し始めます。

一方、ラクトースとスクロースは複雑な炭水化物であり、Embden-Meyerhofサイクルに入るには、分解してグルコースに変換する必要があります。

-グルコースを発酵しない微生物

接種された微生物がグルコースを発酵させることができない場合、他の炭水化物を発酵させることができる量ははるかに少なくなります。したがって、ここでは酸は形成されませんが、ペプトンを使用することでベベルにアミンが形成されます。

この場合、ベゼルはより濃い赤に変わり、チューブの底部は変化しないか、アルカリ化されてチューブ全体が赤くなることがあります。

解釈：K / Kはアルカリベベル/アルカリ性または中性の底を意味します

記事の冒頭の画像で、チューブDの画像を参照してください。

この結果は、微生物が腸内細菌科に属していないことを示しています。

-ラクトース/スクロースを発酵させない微生物

バクテリアがグルコースを発酵できるが、ラクトースやスクロースは発酵できない場合、次のことが起こります。

細菌は約6〜8時間後に存在するすべてのグルコースを消費し、ベベルとブロックの両方を酸性化できます。つまり、寒天は完全に黄色に変わります。しかし、ブドウ糖が枯渇し、乳糖とショ糖を使用できない場合、細菌はタンパク質の代謝を開始します。

この反応には酸素が必要であるため、ペプトンの分解は表面（ベベル）で発生します。生成されたアミンは、ベゼルを黄色から赤色にアルカリ化します。この反応は、18〜24時間のインキュベーション後に明らかになります。

解釈：K / Aは、アルカリベベルと酸ワッドを意味します。

記事の冒頭の画像で、チューブBの画像を参照してください。

-ラクトース/スクロース発酵微生物

ラクトースとスクロースを発酵できる微生物は、明らかにグルコースを発酵することができます。培地に存在する最小量のグルコースが使い果たされた後、形成されたピルビン酸塩は、好気性クレブス回路を通じて代謝されて酸を形成し始め、8〜12時間の期間、すべての培地は黄色になります。

バクテリアがラクトースまたはスクロースを分解する能力がある場合、酸は生成され続け、18〜24時間後、チューブ全体（ベベルおよびプラグ）は黄色のままになります。

グルコースの使用は２つの方法で行われることに注意すべきである：１つは好気的にチューブのベベルで、そしてもう１つは嫌気的にチューブの底で。

解釈：A / Aは、アシッドベベル/アシッドボトムを意味します。ガスがある場合とない場合があります。

記事の冒頭の画像で、チューブAの画像を参照してください。

ガス生産

一部の微生物は、糖の発酵中にガスを生成することができます。ガスは、寒天内にかかる圧力によってチューブ内で明らかになります。圧力は泡の形成または寒天の変位を引き起こします。時々ガスの形成は媒体を破壊することができます。

TSI培地を播種するとき、それが底に到達するまで、パンクが寒天の中心を介してきれいに作られていることが重要です。パンクがチューブの壁の方にそらされると、ガスが誤って形成されたチャネルを通って逃げるため、ガスの生成で誤検知を引き起こす可能性があります。

ガスの生成、および寒天斜面で発生する反応は酸素を必要とするため、チューブを綿栓で覆うことをお勧めします。ベークライトキャップを使用する場合は、完全に締め付けないでください。

ガス生産は、プラス（+）またはマイナス（-）として報告されます。

ガス生成パターン。出典：修士課程によるスキーム。マリエルサ・ギル。画像出典：VeeDunnFlickr.com/Y_tambe、Wikimedia Commons経由

チオ硫酸ナトリウムおよび硫酸第一鉄

硫化水素（無色のガス）を生成できる細菌は、培地に存在するチオ硫酸ナトリウムから硫黄を吸収します。H ₂ Sが形成されると、硫酸アンモニウム第一鉄と反応して硫化鉄（はっきりと見える黒い沈殿物）を生成します。

H ₂ S生成は、陽性（+）または陰性（-）として報告されます。

記事の冒頭の画像で、チューブCの画像を参照してください。

準備

62.5 gの脱水三重糖鉄寒天（TSI）培地を量り、1リットルの蒸留水に溶解します。

寒天が完全に溶解するまで加熱します。1分間沸騰させ、頻繁に攪拌します。4 mlの培地をコットンキャップ付きの13/100試験管に分配します。

121°Cのオートクレーブで15分間滅菌します。オートクレーブから取り出し、斜めに置きます。ベースとベゼルの距離が同じになるように注意する必要があります。

2-8°Cの冷蔵庫に保存します。菌株を播種する前に暖めます。

脱水した培地の色はライトベージュで、調製した培地は赤橙色です。

調製した培地の最終pHは7.3±0.2です。

用途

TSIテストは、微生物学研究室レベルで広く使用されています。このテストは、属と種を識別するために適用する必要があるテストのタイプをガイドするために不可欠です。その優れた実行と解釈により、材料と労力を節約できます。

結果がTSI K / Kであり、チトクロームオキシダーゼテストが陽性である場合、他の属の中で、Pseudomonas、Alcaligenes、Achromobacter、Burkholderiaなどの非発酵グラム陰性桿菌の同定にテストを使用する必要があることが知られています。オキシダーゼ陰性の場合、アシネトバクター属、ステノトロフォモナス属などに向いています。

一方、TSIA / AまたはK / Aが得られ、チトクロームオキシダーゼテストが陰性であれば、より多くの硝酸塩が亜硝酸塩に還元され、腸内細菌科に属する微生物であると確信できます。この場合、識別ルートは、このグループの細菌の特定のテストに焦点を当てます。

一方、K / AまたはA / A画像が得られ、チトクロームオキシダーゼテストが陽性である場合、組み立てられる追加のテストは、次のような腸内細菌科に属さない発酵菌株の同定を目的とします：Aeromonas、プレシオモナス、ビブリオ、パスツレラ。

硫化水素、オキシダーゼ陰性のTSIは、腸内細菌科の次の属の同定を導きます：プロテウス、シトロバクター、エドワードシエラ、レミノレラ、プラギア、トラブシエラまたはサルモネラ。

アルカリ性バックグラウンドとポジティブオキシダーゼを備えたアルカリ性ベベルにほとんどまたは中程度の硫化水素を含むTSIは、Shewanella putrefaciensなどのH ₂ Sを生成する非発酵グラム陰性桿菌の同定のためのテストの使用を導きます。

最後に、TSIは、特にErysipelothrix rhusiopathiaeが疑われる場合、グラム陽性桿菌の硫化水素産生の調査に使用できます。

播種

TSI培地には、初代培養または選択培養で分離された純粋なコロニーを接種する必要があります。混合植物相を含むサンプルを播種した選択培地からコロニーを採取する場合、その培地で阻害された生存株がコロニーの下部に存在する可能性があるため、表面からのみ採取するように注意する必要があります。

したがって、選択培地でループを冷却してはならず、コロニーを採取してTSI培地を接種します。

播種はストレートループまたは針で行われます。真ん中の真ん中から下まで届くように注意しながら穴をあけ、ジグザグ状に接種して播種を終了します。2つの穿刺を行わないでください。

好気性生物で37°Cで18〜24時間インキュベートします。この時点で、前後どちらにも通訳しません。

制限事項

TSIテストは、インキュベーションの18〜24時間以内に読み取る必要があります。この時間以前の測定値は、A / A発酵の偽陽性をもたらす可能性があります。一方、この時間以降の読み取りは、培地をアルカリ化するペプトンの消費のために、非発酵槽の偽陰性画像を生じさせる可能性があります。

参考文献

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