ローウェンスタイン-ジェンセンの媒体が培養可能ではないらい菌種を除いて、とりわけ結核菌、M。アビウムのようなマイコバクテリウム属の細菌の単離および開発のために選択固体培地です。
Mycobacterium属の細菌は、従来の培養培地では増殖しないため、それらを分離するための特別な培地を設計する必要がありました。元のメディアはLöwensteinによって作成され、後にJensenによって修正されました。
結核菌のコロニーを含むレーベンスタイン・イェンセン培地。出典：Agarwal et al / BioMed Central Ltd.、Biology Image Library提供
変更点は、コンゴレッド染料を排除し、マラカイトグリーンを高濃度に置き換えることでした。それはまたクエン酸マグネシウムとリン酸一カリウムの濃度を変えました。
Löwenstein-Jensen培地には現在、ジャガイモデンプン、アスパラギン、クエン酸マグネシウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、マラカイトグリーン、ナリジクス酸、シクロヘキシミド、リンコマイシン、卵、グリセリン、および水が含まれています。
マイコバクテリアは通常、とりわけ、痰、尿、膿瘍などの無菌ではない部位から分離されます。つまり、ほとんどのサンプルには、その地域の通常の微生物叢と病原菌が含まれています。
そのため、レーベンスタインジェンセン培地には、マラカイトグリーン、抗生物質、抗真菌剤に代表される一連の阻害剤が含まれています。
さらに、無菌でない場所に由来するサンプルは、Löwenstein-Jensen培地に播種する前に、除染および中和する必要があります。
基礎
Löwenstein-Jensen培地に卵とグリセリンが存在すると、これらの微生物の発生に必要な脂肪酸とタンパク質が提供されるため、マイコバクテリアの成長が促進されます。
Löwenstein-Jensen培地には、付随する微生物叢の阻害剤であるマラカイトグリーンが含まれています。しかし、グラム陰性菌叢を阻害するナリジクス酸（35 µg / mL）、腐生菌と酵母菌を阻害するシクロヘキシミド（400 µg / mL）、グラム陽性菌叢を阻害するリンコマイシン（2 µ / mL）も含まれています。
一部の商業施設では、抗生物質の次の組み合わせを追加することを好みます：ポリミキシンB 200,000単位/ L、アンフォテリシンB 10 mg / L、カルベニシリン50 mg / L、トリメトプリム10 mg /L。
この培地は寒天を含まないため、滅菌中に卵内に存在するアルブミンが凝固するため、培地の固化が起こります。
準備
グリセロール12 mlが事前に追加されている蒸留水600 ml中の脱水培地37.3 gを計量します。混合物を加熱し、完全に溶解するまで頻繁に攪拌します。培地を121°Cで15分間オートクレーブします。
一方、1000 mlの新鮮な卵の均質な懸濁液は、無菌条件下で準備する必要があります。気泡を避けて、50〜60℃の温度で調製した600mlの培地に卵の懸濁液を追加します。
オートクレーブでの滅菌後、抗生物質溶液も加えられます。
培地を無菌のスクリューキャップ付き試験管に注ぎます。傾斜した位置で85℃で45分間チューブを加熱します。
調製した培地の色はアクアマリングリーンで、卵脂質の存在により白っぽい斑点が現れることがあります。
培地のpHは7.2±0.2でなければなりません
チューブは冷蔵庫に保管し、使用するまで直射日光を避けてください。種まき前に温度を下げます。
「レーヴェンシュタイン・イェンセンの土台の改変」と呼ばれる媒体の改変があります。これには、従来の培地と同じ化合物が含まれていますが、RNA-5mg / 100 mLが追加され、阻害剤としてマラカイトグリーン0.025 g / 100 mL、ペニシリン50 U / mL、ナリジクス酸35 ug / mLが含まれています。
用途
Löwenstein-Jensen培地は、さまざまなタイプのサンプルからマイコバクテリアを分離するために使用されます。マイコバクテリアの存在が疑われる検体には、Ziehl-Neelsen染色が推奨されます。
一部のサンプルは無菌部位からのものですが、そうでないものもあります。非滅菌サンプルは、必要に応じて除染する必要があります。
喀痰
喀痰サンプルは次のように除染する必要があります：喀痰サンプルの量をml単位で決定し、同量の4％NaOHをサンプルに加え、37°Cでインキュベートします。
30分以内に頻繁に混合物を振る。続いて3000 RPMで30分間遠心します。
フェノール系消毒液で上清を捨てます。播種には沈殿物を使用しますが、最初にpHを中和する必要があります。
沈殿物を中和するために、5％H 2 SO 4がフェノールレッド指示薬の存在下で、それが中性のpHに達してサケの色を引き起こすまで使用されます。
胃洗浄、気管支洗浄、および気管支吸引物
この場合、サンプルは3000 RPMで30分間遠心分離する必要があります。上清を捨て、ペレットを使用します。沈殿物を浄化するために、4％NaOHを3 ml加え、37°Cで30分頻繁に攪拌します。
再度遠心し、上清を捨て、ペレットを使用します。後者は、痰サンプルで説明されているように中和する必要があります。
尿
サンプルを冷蔵庫で24時間静置します。上清を分離します。残りのペレットは3000 RMPで30分間遠心します。再び上清を捨て、滅菌生理溶液3 mlでペレットを再構成します。
4％NaOHを3 ml加え、前述のように除染と中和に進みます。
腹水、胸膜液、脳脊髄液
このタイプのサンプルでは、遠心分離され、上清が廃棄されます。堆積物でグラムを実行するか、顕微鏡で直接観察します。細菌が観察されない場合、除染ステップは不要であり、中和ステップも不要です。
この場合、沈殿物を使用してサンプルを直接播種できます。バクテリアが存在する場合は、上記のように除染と中和に進んでください。
生検
このタイプのサンプルには、5 mlの蒸留水を加えて、1500 RPMで10分間遠心します。上清を捨て、ペレットを3500 RPMで30分間遠心します。培地を播種するために沈殿物を使用してください。
喉頭スワブ
綿棒は、等量の蒸留水と4％NaOHを含む滅菌チューブに入れてください。綿棒をチューブの壁に押し付けて、サンプルが液体で希釈されるようにする必要があります。遠心分離し、沈殿物を使用します。すでに説明したように堆積物を中和します。
播種
Löwenstein-Jensen培地は、培地の表面に0.5 mlのサンプルを追加することによって接種されます。チューブを回転させて、サンプルを培地全体に分散させます。プラチナハンドルは使用しないでください。
ストーンブリンク培地を含む2番目のチューブに播種して、マイコバクテリウムボビスおよびレーベンスタインジェンセン培地で成長しない他の種を分離することができます。
インキュベーション
接種したチューブを37°Cで好気的にインキュベートし、キャップを少し緩め、約5°に傾け、光から保護します。環境は5〜10％の二酸化炭素で強化できます。コロニーが現れるまで、週に2回培養を確認します。
サンプルが吸収されたら、キャップを締めます。最大潜伏時間は8週間です。この時間が経過しても増殖が見られない場合は、陰性と報告されます。
QA
以下の菌株は品質管理として使用することができます：
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294、Mycobacterium kansasii ATCC 12478、Mycobacterium avium ATCC 19291、Mycobacterium bovis ATCC 19219、Mycobacterium fortuitum ATCC 6841、Escherichia coli ATCC 25922、Streptococcus pyogenes ATCC 19615、Cryptococcus 320of of CCCC of AToccocus 320 of ATCC
M. fortuitumの成長は良好であるべきである一方、M。bovisの成長はほとんどまたはまったく期待されないため、言及された最初の3種については優れた開発が期待されます。一方、マイコバクテリウム属以外の種は完全に阻害されなければならない。
制限事項
準備した培地は光から保護する必要があります。長時間光にさらすと、培地が緑から青に変わります。この場合、培地は使用できなくなります。マラカイトグリーンは感光性があるためです。
培地には卵が含まれているため、無菌で取り扱わないと汚染されやすくなります。タンパク質分解性細菌で汚染された場合は溶解できます。
マイコバクテリウム属の細菌の培養と取り扱いには、汚染や他人への汚染を避けるために従わなければならないバイオセーフティ対策を知っている有資格者が必要です。
塩化ナトリウムの形成は、コッホ桿菌にとって有毒である可能性があるため、HClは中和ステップでは使用しないでください。
処理されていないサンプルは、冷蔵保存し、遮光してください。
参照
- フランシスコソリアメルギゾラボラトリーズ。2009.レーウェンシュタイン-ジェンセン選択培地。で利用可能：f-soria.es
- ブリタニア研究所。2017.レーウェンシュタイン-ジェンセン媒体。入手可能：britanialab.com。
- Neogen Laboratories。Löwenstein-Jensenミディアム。で入手可能：foodsafety.neogen.com。
- 「レーウェンシュタイン-ジェンセンミディアム」ウィキペディア、フリー百科事典。2018年11月20日15:15 UTC。2019年4月24日18:34。wikipedia.org
- Koneman E、Allen S、Janda W、Schreckenberger P、Winn W（2004）。微生物学的診断。第5版 エディトリアルPanamericana SAアルゼンチン。
- Forbes B、Sahm D、Weissfeld A.（2009）。ベイリーとスコットの微生物学的診断。12 ed エディトリアルPanamericana SAアルゼンチン。
- Mac Faddin J（2003）。臨床的に重要な細菌の同定のための生化学的検査。第三版 社説パンアメリカーナ。ブエノスアイレス。アルゼンチン。