DNAシーケンス：MAXAM-GILBERT、方法および例 - 生物学 - 2025

DNA配列決定（デオキシリボ核酸）を可能にする分子生物学実験室における手順であるために、目的の遺伝物質中のヌクレオチドの順序を知っています。さらに、ＲＮＡ（リボ核酸）の配列決定も開示することができる。

この技術は生物科学の発展に不可欠でした。また、医療診断や法医学調査など、他の知識分野にも適用できます。

出典：pixabay.com

以前は、DNA鎖のシーケンシングは低速で高価なアクティビティと見なされていたため、オリゴヌクレオチド内の数塩基対しか識別できませんでした。

今日、科学のすべての進歩により、DNAシーケンスは、この分野での約50年間の研究の貢献のおかげで、世界中の多くの研究所で日常業務となっています。チェーンの長さに関しては、非常に短い時間で数百万までの塩基対をシーケンスできます。

これを行うには、価格と精度が異なる数十の技術が開発されています。この記事では、古典的手法と現代的手法の両方について、それぞれ長所と短所を説明します。

これまで、シーケンス技術により、小さな原核生物や酵母からヒトゲノムまで、完全なゲノムのシーケンスを取得できます。

DNAの構造

DNAシーケンスに使用される方法と手法を理解するには、分子の構造と組成の特定の重要な側面を知る必要があります。

DNAは、細菌から大型の水生動物まで、すべての生物に見られる生体分子です。オルガネラ-ミトコンドリアや葉緑体のような-中には環状のDNA分子があります。一部のウイルスでさえ、発見された遺伝物質はDNAです。

構造的に、DNAはヌクレオチドの集まりです。それぞれが炭水化物、窒素含有塩基（A、T、CまたはG）およびリン酸基で構成されています。DNAシーケンスの目的は、シーケンス内で4つの窒素含有塩基が見つかる順序を明らかにすることです。

歴史

1950年代半ばに、研究者ワトソンとクリックは、クリストグラフィー技術を使用してDNAの構造を説明しました。しかし、これらの研究者は誰もシーケンスを解明する方法を見つけることができませんでした。

前任者もいましたが、最も重要な出来事は1977年のサンガー法の作成でした。この方法の父であるフレデリックサンガーはイギリスの生化学者であり、生物科学への多大な貢献により2つのノーベル賞を受賞しました。

この技法は、文献では「連鎖停止」またはジデオキシヌクレオチドとしても知られています。この技術の原理と、その改善と革新に基づいて開発されたものを以下に説明します。

サンガー法

サンガー法の開発は、分子生物学における重要な出来事でした。これには、通常細胞内で発生するDNA複製プロセスの基本コンポーネントが含まれますが、特別なコンポーネントであるジデオキシヌクレオチドが追加されます。

反応の主成分

-DNAポリメラーゼ：DNAポリメラーゼ酵素はプロセスの重要な要素です。この分子はDNA鎖の複製に関与し、その役割は新しい鎖の合成であり、三リン酸デオキシリボヌクレオチドを相補的なものと対にします。

DNAでは、チミン（T）は2つの水素結合を介してアデニン（A）とペアになり、シトシン（C）は3つの結合を介してグアニン（G）とペアになります。

-ヌクレオチド：サンガーシーケンスには、2種類のヌクレオチド、4つの2'-デオキシヌクレオチド（dATP、dGTP、dCTP、dTTPと省略）と4つのジデオキシヌクレオチド（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP）が含まれます。

ジデオキシヌクレオチドは、通常DNAに組み込まれるモノマーに似ていますが、その構造には-OHグループがありません。これにより、鎖に新しいヌクレオチドを追加することが不可能になります。

したがって、特別なヌクレオチドが完全にランダムな方法で形成中の鎖に追加されると、合成が麻痺します。したがって、反応の終わりに、異なるサイズの鎖があり、それぞれが反応が異なる点で停止した。

実験的には、4つのテストが用意されています。それぞれには、対象の生体サンプルから抽出されたDNA、通常のヌクレオチド、および4つの特殊なヌクレオチドタイプの1つが含まれています。特殊なヌクレオチドは、何らかのタイプの蛍光マーカーでマークされています（以下の自動シーケンスを参照）。

結果を読む

最初のステップは、サイズに従って合成された各チェーンを分離することです。特別な基地が組み込まれた場所に応じて、いくつかは他のものよりも長くなります。

サイズを識別特性として使用して、混合物の成分の分離を可能にするさまざまな生化学的手法があります。サンガーの方法では、異なる鎖が電気泳動によって分離されます。より洗練された手法のバリエーションでは、キャピラリー電気泳動が使用されます。

したがって、より長いストランドは、より短いバリアントよりも移動が少なくなります。このシステムは、各ジデオキシヌクレオチドに含まれるマーカーを認識するリーダーを通過します。このようにして、シーケンスの順序を知ることができます。

この「第1世代」の技術は、1キロベース以下のDNAフラグメントを読み取ることができます。現在、サンガー法はさまざまなラボで、一般的にはその近代的な変種で使用されています。さらに、最も複雑な手法で得られた結果を裏付けるために使用されますが、精度は低くなります。

自動シーケンス

大規模なシーケンス処理が必要な場合、プロセスは自動化によって加速されます。これは、サンガーチェーンターミネーション法のバリエーションで、プライマーを区別するためにプライマーを蛍光産物で標識します。

続いて、反応生成物を電気泳動で実行します-すべて単一のレーンで。各フラグメントがゲルの最後の部分から出ると、1％の誤差で蛍光標識によって迅速に識別されます。

最も洗練されたシステムには、ロボットに接続されたコンピュータによって管理される最大96本の毛細管のシステムがあります。つまり、96個のDNAサンプルを同時にテストできます。したがって、電気泳動と結果の分析を含むプロセスは完全に自動化されています。

これらのシステムは、1日で最大550,000塩基のシーケンスを行うことができます。プロセス中、人の手間は不要で、メソッドの開始には約15分しかかかりません。

Maxam-Gilbertシーケンス

サンガーが彼の研究を発表したと同時に、アランマキサンとウォルターギルバートという2人の研究者が、DNA配列を取得する別の方法の開発に成功しました。この方法は当時人気を博しましたが、後にサンガーの方法の改善により置き換えられました。

サンガー法とは対照的に、マクサンとギルバートのシーケンス（または化学シーケンス、これも知られている）は、ハイブリダイゼーション反応を含みません。この方法論は、一方の端を反応剤で標識し、その後精製プロセスを行うことで構成されています。

この手法のマイナス面の1つは、その非常に複雑さと、ユーザーにとって危険な化学物質の使用にあります。ケミカルブレイクは、DMS、ギ酸、ヒドラジン、およびヒドラジンと塩の併用によって引き起こされます。

処理する

プロトコルは、リンマーカー32でストランドの5 '端をラベリングすることから始まり、その後、窒素塩基の化学修飾が起こり、分離されます。最後に、脱塩基領域の切断が起こります。

最初に、シーケンスする文字列を短いセグメントに短縮します。このステップは、制限酵素を使用して実行され、その結果、末端が突出します。

次に、アルカリホスファターゼを用いて反応を行います。その目的は、リン酸基を除去することです。したがって、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識を行うことができる。

チェーンは変性しています（2つのストランドが開いています）。次に、化学物質が塗布されます。これらの開裂反応は制御された方法で行われ、それぞれがどのような種類の結合を適用して化学的に切断されるかがわかっています。

結果を読む

サンガー法と同様に、結果の読み取りには、電気泳動システムで得られた鎖のサイズによる分離が含まれます。ポリアクリルアミドで構成されたシステムは、ゲルを読み取るために非常に適切な解像度を得ることができます。

大量シーケンス

大規模なシーケンシングには、英語の「次世代シーケンシング」からの、NGSと略される一連の新しい方法が含まれます。

NGSとして分類された方法は、前のDNA増幅ステップを必要とします（単一の分子では機能しません）。さらに、使用されるプラットフォームは大きく異なります。最も一般的な方法の原理を以下に説明します。

パイロシーケンス

これには、新しいヌクレオチドがDNA鎖に追加されるたびに発生するピロリン酸塩の放出の監視が含まれます。酵素のシステムが結合されているため、新しいヌクレオチドが組み込まれるたびに（カメラで検出可能な）光が放出されます。

プロセスは、発光があるかどうかを確認するために、各窒素ベースの個別のインキュベーションから始まります。パイロシーケンスは長いストランドを読み取ることができますが、見つかったエラー率は高くなります。

合成シーケンス

これには、標識ヌクレオチドの取り込みが含まれます。これらの蛍光成分が加えられ、洗浄され、組み込まれたヌクレオチドが記録されます。次に、ヌクレオチドラベルが削除され、鎖の合成が続行されます。次のステップでは、標識されたヌクレオチドも組み込まれ、前述のステップが繰り返されます。

この手法の欠点は、蛍光マーカーが完全に除去されない場合に発生します。これらの放出はバックグラウンドエラーを引き起こし、重大なエラーを引き起こします。

ライゲーションシーケンス

この手法はDNAポリメラーゼを使用しないため、他の手法とは異なります。代わりに、この方法論の鍵となる酵素はリガーゼです。ここでは、蛍光標識されたDNA断片が使用され、酵素によって結合され、検出されます。

この手法の最大の問題は、処理できるフラグメント長が短いことです。

イオントレントシーケンス

この手法は、新しいヌクレオチドが取り込まれるたびに放出されるH ⁺イオンの測定に基づいています。原理はパイロシーケンスと非常に似ていますが、はるかに安価です。

例

ヒトゲノムの配列決定

ヒトゲノムの配列決定は、生物学において最も有望な課題の1つであり、科学の歴史において最も高く評価されている競争の1つでもあります。実際、プロジェクトに参加した科学者にとって、ゲノムの配列決定は競争となりました。

1990年、有名な科学者であるノーベル賞受賞者のジェームズワトソンが率いる「ヒトゲノムプロジェクト」を開始しました。1年後の1991年に、ベンターはワトソンを「打ち負かし」、その前にゲノムの配列を決定することに挑戦しました。しかし、1992年にワトソンは引退し、その指揮は別の研究者によって行われました。

1995年に、ベンターはランダムシーケンス法による細菌ゲノムの完全なシーケンスでの成功を発表しました。同様に、反対チームは1年後に酵母ゲノムの配列決定を発表しました。

2000年に学位は終了しました。両社は、科学の最も権威のある2つのジャーナルであるNatureとScienceに、予備的な全ゲノム結果を公開しました。

しかし、科学者たちは提案の改善に引き続き取り組み、2006年に特定のヒト染色体の配列が完成しました。

重要性とアプリケーション

DNAなどの重要な分子のヌクレオチドの順序を知ることは、生物学者や関連する専門家にとって貴重です。この一連のポリヌクレオチドには、あらゆる形態の生命の発達と維持に必要なすべての情報が含まれています。

これらの理由により、このシーケンスの知識は生物学的研究に不可欠です。基本的に、シーケンス処理により、生物学的システムの最も重要な特性の1つを測定し、それらの間の差異を確立することが可能になります。

特定のDNAシーケンスにより、2つの生物が同じ種に属しているかどうかを判断するための基準を確立できるほか、それらの間の系統関係に関する仮説を提案できるため、シーケンスは分類学者や分類学者によって広く使用されています。

さらに、DNAシーケンスは、医学や診断に応用できます。たとえば、シーケンシングを通じて、いわゆる一塩基多型（SNP）を使用して特定の疾患（癌など）を発症する傾向を評価できる、安価でアクセス可能なシステムがあります。

犯罪者タイプおよび法医学タイプの調査は、特定の個人が犯罪に参加したことの信頼できる証拠として使用できるシーケンシング手法によっても強化されています。

参考文献

1. Heather、JM、&Chain、B.（2016）。シーケンサーのシーケンス：DNAシーケンスの歴史。ゲノミクス、107（1）、1-8。
2. コボルト、DC、スタインバーグ、KM、ラーソン、DE、ウィルソン、RK、およびマーディス、ER（2013）。次世代シーケンシング革命とそのゲノミクスへの影響。セル、155（1）、27-38。
3. Levy、J.（2010）。科学的な競争。ガリレオからヒトゲノムプロジェクトへ。社説Paraninfo。
4. サンガー、F。、ニックレン、S。&クルソン、AR（1977）。連鎖停止阻害剤を用いたDNAシーケンシング。国立科学アカデミーの議事録、74（12）、5463-5467。
5. Schuster、SC（2007）。次世代シーケンシングは、今日の生物学を変革します。自然法、5（1）、16。
6. Xu、J.（編）。（2014）。次世代シーケンシング。Caister Academic Press。