制限酵素は、阻害または内部のウイルスの拡散を「制限する」ために、特定の古細菌によって用いエンドヌクレアーゼです。それらは細菌で特に一般的であり、制限/改変システムとして知られている外来DNAに対する防御システムの一部です。
これらの酵素は、特定の場所でのダブルバンドDNAの切断を触媒し、追加のエネルギーを使用せずに再現性よく行います。ほとんどは、マグネシウムまたは他の二価カチオンなどの補因子の存在を必要としますが、ATPまたはS-アデノシルメチオニンを必要とするものもあります。
HindIII制限酵素反応スキーム（出典：Wikimedia CommonsのHelixitta）
制限エンドヌクレアーゼは、その発見によりノーベル医学賞を受賞したダニエルネイサンズ、アーバーヴェルナー、ハミルトンスミスによって1978年に発見されました。彼らの名前は一般に、最初に観察された生物に由来します。
このような酵素は、DNAクローニング法の開発、その他の分子生物学および遺伝子工学戦略で広く使用されています。それらの特定の配列認識特性および認識部位に近い配列を切断する能力は、それらを遺伝子実験における強力なツールにします。
特定のDNA分子に作用した制限酵素によって生成されたフラグメントは、酵素がDNAを切断した部位に関する情報を使用して、元の分子の「マップ」を再作成するために使用できます。
一部の制限酵素はDNAに同じ認識部位を持っている可能性がありますが、必ずしも同じように切断するわけではありません。したがって、分子生物学において異なる用途を有する、平滑末端を残して切断する酵素および粘着末端を残して切断する酵素が存在する。
現在、数百の異なる市販の制限酵素があり、さまざまな商業施設から提供されています。これらの酵素は、さまざまな目的で「カスタム」分子はさみとして機能します。
特徴
制限酵素は、ヌクレオチド鎖内の隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合内のエステル結合を加水分解または切断するため、ポリメラーゼの反対の機能を果たします。
分子生物学および遺伝子工学では、発現およびクローニングベクターの構築、ならびに特定の配列の同定に広く使用されています。それらは組換えゲノムの構築にも有用であり、バイオテクノロジーの大きな可能性を秘めています。
遺伝子治療における最近の進歩は、生きている細胞へのそのような遺伝子の輸送のためのビヒクルであり、おそらく実行するために細胞ゲノムに挿入する能力を有するベクターへの特定の遺伝子の導入のための制限酵素の現在の利用を作ります恒久的な変更。
作用機序
制限酵素は、ダブルバンドDNA切断を触媒することができますが、シングルバンドDNA配列やRNAさえも認識できるものもあります。シーケンスの認識後に切断が発生します。
作用機序は、各DNA鎖の骨格にあるリン酸基とデオキシリボースの間のリン酸ジエステル結合の加水分解で構成されています。多くの酵素は、それらが認識する同じ部位で切断することができますが、他の酵素は、その前または後に5〜9塩基対を切断します。
通常、これらの酵素はリン酸基の5 '末端で切断し、5'ホスホリル末端と3 '末端ヒドロキシル末端を持つDNAフラグメントを生成します。
タンパク質はDNAの認識部位と直接接触しないため、おそらくDNA鎖の「スライド」メカニズムによって、特定の部位が達成されるまで連続的に転位する必要があります。
酵素による切断中、各DNA鎖のホスホジエステル結合は、制限酵素の活性部位の1つ内に配置されます。酵素が認識部位と切断部位を離れると、非特異的な一過性の会合を介して去ります。
タイプ
現在、5種類の制限酵素が知られている。それぞれの簡単な説明を次に示します。
I型制限酵素
これらの酵素は、3つのサブユニットを備えた大きな五量体タンパク質です。1つは制限用、もう1つはメチル化用、もう1つはDNAの配列認識用です。これらのエンドヌクレアーゼは、制限および修飾反応を触媒できる多機能タンパク質であり、ATPase活性とDNAトポイソメラーゼを持っています。
このタイプの酵素は、発見された最初のエンドヌクレアーゼであり、1960年代に最初に精製され、それ以来ずっと深く研究されてきました。
I型酵素は、切断部位が認識部位から最大1,000塩基対のさまざまな距離にある可能性があるため、バイオテクノロジーツールとして広く使用されていません。
タイプII制限酵素
それらは、ホモダイマーまたはテトラマーから構成される酵素であり、長さが4〜8 bpの特定の部位でDNAを切断します。これらの切断部位は、通常パリンドロームです。つまり、これらの部位は、両方向で同じように読み取られる配列を認識します。
バクテリアのタイプII制限酵素の多くは、DNAが本来持つべき典型的な修飾がないため、異質性を認識するとDNAを切断します。
これらは、DNA配列を認識して切断するためにマグネシウム（Mg +）以外の補因子を必要としないため、最も単純な制限酵素です。
タイプII制限酵素は、DNAの単純な配列を正確な位置で認識して切断する精度を備えているため、分子生物学のほとんどの分野で最も広く使用されており、不可欠なものの1つです。
タイプII制限酵素のグループ内には、それぞれに固有の特定のプロパティに従って分類された複数のサブクラスがあります。これらの酵素の分類は、酵素の名前の後にAからZまでのアルファベットの文字を追加することによって行われます。
有用性で最もよく知られているサブクラスには、次のものがあります。
サブクラスIIA
それらは異なるサブユニットの二量体です。それらは非対称配列を認識し、切断酵素の生成のための理想的な前駆体として使用されます。
サブクラスIIB
それらは1つ以上の二量体で構成され、認識配列の両側でDNAを切断します。彼らはDNAの両方の鎖を認識部位の前の塩基対間隔で切断した。
サブクラスIIC
このタイプの酵素は、DNA鎖の分裂と修飾の機能を持つポリペプチドです。これらの酵素は両方の鎖を非対称的に切断します。
サブクラスIIE
このサブクラスの酵素は遺伝子工学で最も使用されています。それらは触媒部位を有し、一般にアロステリックエフェクターを必要とする。これらの酵素は、効率的な切断を行うために、認識配列の2つのコピーと相互作用する必要があります。このサブクラス内には、酵素EcoRIIおよびEcoRIがあります。
III型制限酵素
III型制限エンドヌクレアーゼは2つのサブユニットのみで構成され、1つはDNAの認識と修飾に関与し、もう1つは配列切断に関与します。
これらの酵素の機能には、ATPとマグネシウムの2つの補因子が必要です。このタイプの制限酵素は2つの非対称認識部位を持ち、ATP依存的にDNAを移動させ、認識部位に隣接する20〜30 bpの間で切断します。
タイプIV制限酵素
IV型酵素はメチル化マークでDNAを切断するため、簡単に識別できます。これらの酵素は、DNA配列の認識と切断に関与するいくつかの異なるサブユニットで構成されています。これらの酵素は、GTPと二価のマグネシウムを補因子として使用します。
特定の切断部位には、核酸の一方または両方の鎖にメチル化またはヒドロキシメチル化シトシン残基を有するヌクレオチド鎖が含まれる。
V型制限酵素
この分類はCRISPER-Casタイプの酵素をグループ化し、侵入する生物から特定のDNA配列を識別してカットします。Cas酵素は、CRISPER合成ガイドRNAの鎖を使用して、侵入生物を認識して攻撃します。
タイプVに分類される酵素は、タイプI、II、およびIIの酵素によって構成されたポリペプチドです。彼らはほとんどすべての生物のDNAの切片を切断することができ、長さの範囲が広い。その柔軟性と使いやすさにより、これらの酵素はII型酵素とともに、今日の遺伝子工学で最も広く使用されているツールの1つになっています。
例
ヌクレオチド置換の割合に関する情報を得るために、特に集団遺伝学研究およびミトコンドリアDNAを使用する進化研究において、DNA多型の検出に制限酵素が使用されてきました。
現在、様々な目的で細菌の形質転換に使用されるベクターは、複数の制限酵素の認識部位が見つかるマルチクローニング部位を持っています。
これらの酵素の中で最も人気のあるのは、EcoRI、II、III、IV、およびVであり、E。coliから初めて取得および説明されました。H. influenzaeのHindIIIおよびB. amyloliquefaciensのBamHI。
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