胞子染色は、不利な条件でいくつかの細菌属を形成する抵抗構造体を着色するために使用される方法です。これらの構造は、生存の形式に対応しています。
胞子を形成する多くの属があります。ただし、主なものはバチルスとクロストリジウムです。これらの属は、人間に病原性の種があるため、より関連性が高いと考えられています。
Shaeffer – FultonまたはWirtz-Conklin法による胞子染色。ウィキメディア・コモンズのtambe（元のアップローダー）
それぞれの桿菌は胞子を引き起こすことができます。プレパレーションを染色するとき、胞子はバチルス内（エンドスポア）またはバシラスの外（エクスポスポア）に見られます。グラム染色などの細菌の従来の染色技術では、胞子は無色のままです。
現在、胞子の厚い構造を透過して染色することができる染色方法がいくつかあります。これらの方法は非常に多様です。これらには、ドーナーテクニック、メラー染色、シェーファー-フルトン法（Wirtz-Conklinとしても知られています）が含まれます。
言及されたすべての手法の中で、シェーファー・フルトンの方法論は、日常の検査室で最も広く使用されています。1930年に着色を作成した2人の微生物学者、アリシアシェファーとマクドナルドフルトンにちなんで名付けられました。ただし、この技法は、1900年代の2人の細菌学者にちなんでWirtz-Conklinと呼ばれることもあります。
基礎
彼らは非常に厚い壁を持っているため、胞子は従来の汚れで汚れません。胞子の複雑な組成は、ほとんどの着色剤の侵入を防ぎます。
胞子を外側から調べた場合、次の層が観察されます。最初に、糖タンパク質によって形成される最も薄い外層である外膜があります。
次に、高温に対する耐性を提供するキューティクルが続き、次にペプチドグリカンで構成される皮質が続きます。後でプロトプラストを保護するベースの壁です。
胞子は15％のカルシウムとジピコリン酸を含む脱水構造です。したがって、ほとんどの胞子染色技術は、染料が厚い構造に浸透できるように、熱の適用に依存しています。
胞子が染色されると、色素を取り除くことができません。Shaeffer – Fulton技術では、マラカイトグリーンが栄養細胞に入り、熱が加えられると、内生胞子と外生胞子を貫通します。
水で洗浄することにより、栄養細胞から色素が除去されます。これは、マラカイトグリーン染料がわずかに塩基性であるために発生し、栄養細胞に弱く結合します。
代わりに、それは胞子から出ることができず、結局、細菌はサフラニンで対比染色されます。この基盤は、同様のことが発生する残りの手法にも当てはまります。
胞子染色技術
胞子染色を行うには、調査する疑わしい株の純粋な培養物を入手する必要があります。
培養物は、微生物を刺激して胞子形成させるために、24時間、極端な温度にさらされます。このために、培養物は44℃のオーブンまたは冷蔵庫（8℃）に24または48時間置くことができます。
上記の温度で長時間放置すると、すべての内生胞子がすでに細菌を出ているため、外生胞子のみが観察されます。
時間の最後に、数滴の滅菌生理溶液を清潔なスライドの上に置きます。次に、培養液のごく一部を採取し、細かく広げます。
その後、放置して乾燥させ、熱で固定し、以下で説明する技法のいずれかで染色します。
ドーナーテクニック
1-蒸留水で胞子形成微生物の濃縮懸濁液を試験管で調製し、等量のろ過されたKinyounカルボフクシンを加えます。
2-チューブを沸騰したお湯の入ったバスに5〜10分間置きます。
3-きれいなスライド上で、前の懸濁液1滴を10％ニグロシン水溶液1滴と混合し、沸騰させてろ過します。
4-穏やかな熱ですばやく広げて乾かします。
5- 100X対物レンズ（液浸）で調べます。
胞子は赤く染まり、細菌細胞は暗い灰色の背景に対してほとんど無色に見えます。
修正ドーナーテクニック
1-胞子形成微生物の懸濁液をスライドに広げ、熱で固定します。
2-サンプルは、カルボフクシンが添加された濾紙ストリップで覆われています。蒸気の発生が発生するまで、ブンゼンバーナーの炎で着色剤を5〜7分間加熱します。その後、紙が取り除かれます。
3-製剤を水で洗浄し、吸収紙で乾燥させます。
4- 2番目のスライドを使用してニグロシンまたは針を広げ、10％ニグロシンの薄膜で塗抹標本を覆います。
胞子および細菌によってとられる着色は、先行技術に記載されているものと同じである。
Shaeffer – FultonまたはWirtz-Conklinテクニック
1-スライド上の胞子形成微生物の懸濁液で細かい塗抹標本を作り、熱で固定します。
2-スライドを5％マラカイトグリーン水溶液でカバーします（スライド上にろ紙を置くことができます）。
3-ブンゼンバーナーの炎を加熱して蒸気を放出させ、炎を取り除きます。この操作を6〜10分間繰り返します。マラカイトグリーン溶液が手順中に蒸発しすぎる場合は、さらに追加することができます。
4-ろ紙（取り付けられている場合）を取り外し、水で洗浄します。
5-スライドを0.5％水性サフラニンで30秒間カバーします（この技法の一部の変形では、0.1％水性サフラニンを使用し、3分間放置します）。
この手法では、胞子は緑色に、桿菌は赤色に見えます。
若い培養の内生胞子は、非常に透明または無色に見えるため、よく染色されないという欠点があります。これを回避するには、48時間の培養を行うことをお勧めします。
メラー技法
1-塗抹標本をクロロホルムで2分間覆う。
2-クロロホルムを廃棄します。
3- 5％クロム酸で5分間覆います。
4-蒸留水で洗う
5-シートは炭水化物フクシン-フェニカーダで覆われ、蒸気の放出までブンゼンバーナーの炎にさらされます。その後、しばらくの間炎から取り除かれます。この操作は、10分が完了するまで繰り返されます。
6-水で洗います。
7-酸性エタノール（塩酸アルコール）を使用して変色させます。20〜30秒放置します。
8-蒸留水で洗浄します。
9-シートをメチレンブルーで5分間覆うことにより、コントラストを整えます。
10-蒸留水で洗浄します。
11-乾燥させて、サンプルを顕微鏡に移します。
胞子は赤く、桿菌は青く見えます。蒸気は有毒であり、長期的には発がん性があるため、蒸気を吸い込まないことが重要です。
熱のない修正メラー法
2007年、葉山と彼の共同研究者は、メラー技法の修正版を作成しました。彼らは染料を加熱するステップを排除し、10 mlのカルボフクシン-カルボオール溶液ごとに2滴の界面活性剤Tergitol 7を加えることでそれを置き換えました。同じ結果が得られた。
用途
胞子の染色は、その存在、その形状、細菌内の位置、および栄養細胞を変形させる能力かどうかが種を導くことができるデータであるため、病原体の同定のための非常に貴重で有用な情報を提供します特定のジャンルに関わる。
この文脈では、胞子は円形または楕円形である可能性があり、それらは中心に位置することも、傍中心、亜分位または終末位置に位置することもできることは言うまでもありません。
内生胞子と外生胞子の形状と位置の図
例
-クロストリジウムディフィシルは、細菌を変形させる最終位置で楕円形の胞子を形成します。
-クロストリジウムテルチウムの胞子は楕円形で、桿菌を変形させず、末端レベルにあります。
-クロストリジウムテタニの内生胞子は末期であり、桿菌のように変形して桿菌のように見えます。
-Clostridium botulinum、C。histolyticum、C。novyおよびC. septicumの胞子は、円形または亜末端の楕円形で、桿菌を変形させます。
-Clostridium sordelliの内生胞子は中央の位置にあり、わずかに変形しています。
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