細菌塗抹標本：特徴と準備 - 生物学 - 2025

細菌スミアが薄膜であるスミア光学顕微鏡下で観察するために、透明なガラス板またはスライド上に作られる細菌微生物の懸濁液。

微生物をグループ化すると観察が明確にならないため、微生物を可能な限り分離するために、フィルムの形での伸長が行われます。

図1.走査型電子顕微鏡で見た細菌の塗抹標本。出典：pixbay.com

細菌培養の研究では、塗抹標本の準備、固定、染色技術を使用して、それらをよりよく分析します。微生物のサイズが小さいため、光学顕微鏡を使用して観察する必要があります。

光学顕微鏡は、塗抹標本を観察するために不可欠な機器です。これらは、光学レンズと光を使用して、高倍率でサンプルを観察できます。

一般に、生細胞はほとんど着色された構造を持たず、光学顕微鏡で見ると、無色透明なサンプルであり、内部コントラストと環境とのコントラストはほとんどありません。

補助染色技術を使用しない単純なライトフィールドライト顕微鏡での観察は非常に制限されており、微生物の動きの観察など、一部の場合にのみ使用されます。

微生物を最適に観察するには、コントラストと解像度のバランスを取る必要があります。細胞の細部は、高解像度でも顕微鏡下では見ることができません。染料の使用は、観察のためのコントラストを提供する染色技術を介して必要です。

良質の細菌塗抹標本の特徴

優れたコントラスト

優れたコントラストを実現するために、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、暗視野顕微鏡と呼ばれる高度な顕微鏡があります。このタイプの顕微鏡は、とりわけシースやフィラメントなどの細菌構造を観察するために使用されます。

染色は明視野顕微鏡で達成されるコントラストを高めるための簡単な手法です。この技法では、顕微鏡観察を大幅に向上させるさまざまな染色を使用できます。

染色は、スライド上の微生物懸濁液の塗抹標本または拡張部分に直接行われ、事前に乾燥および固定されています。

良い修正

固定は、細胞構造を維持するために使用される手法です。微生物の不活性化とスライドガラスへの付着を引き起こします。固定処理にはさまざまなものがあります。熱固定と化学固定です。

熱固定

これは、細菌の塗抹標本を観察するために最も広く使用されている方法です。テクニックは、スミアの細菌懸濁液をライターの炎に通すことから成ります。この技術は、細菌の外部形態を維持することができますが、それらの内部構造を破壊します。

化学固定

化学的固定は、ホルムアルデヒドやホルマリン、エタノール、酢酸などの保存用化学薬品を使用します。化学固定剤を使用する利点は、微生物の内部細胞構造の保存が達成されることです。

図2.血液塗抹標本。出典：Bobjgalindo、Wikimedia Commons

良好な染色

以前に乾燥および固定された塗抹標本を染色するための最も一般的な手順は、陽性または単純染色、示差染色、および陰性染色です。特定の細胞構造（カプセル、胞子、鞭毛）を染色するための特別な技術もあります。

陽性染色または単純染色

陽性染色または単純染色は、最も広く使用されている塗抹染色技術です。これは、特定の微生物構造に結合する能力を持つ色素を使用しており、それらを顕微鏡で観察することができます。

これらの染料は、化学構造に発色団（着色部分）があり、二重結合と単結合（共役）が交互になっています。これらの結合は、いくつかの細胞構造とのイオン結合または共有結合を確立することができます。

ポジティブまたはシンプルな染色で使用される染料は、主にアニリンの化学誘導体（着色有機塩）です。

一方、染料の中には、塩基性pHのものと酸性pHのものがあります。

基本的な着色剤

塩基性染料では、発色団は正の電荷を持っています。原核微生物の大部分は中性の内部pHを持ち、その細胞表面は負に帯電しています。この静電相互作用により、発色団は細胞に結合して染色します。

塩基性染料の例は、とりわけメチレンブルー、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、塩基性フスチン、サフラニンである。

酸性染料

酸性染料では、発色団は負の電荷を帯びています。これらは、正に帯電したアミノ基でタンパク質を染色するために使用されます。酸性染料の例は、酸性フスチン、ローズベンガル、コンゴレッド、およびエオシンです。

示差染色

示差染色技術は、顕微鏡下で異なる微生物を区別するために、異なる色または強度の2つの染料を適用することで構成されます。グラム染色および酸-アルコール耐性染色は、細菌学で最も一般的に使用される示差染色です。

グラム染色は、形状、サイズ、細胞のグループ化、および細胞壁の種類を知るための予備テストとして使用されます。グラム染色試験を用いて、細胞壁細菌はグラム陽性菌とグラム陰性菌に分類されます。

ネガティブ染色

この技術では、細胞の内部には浸透せず、微生物が含まれる培地を黒い背景として表示する化学染料が使用されます。

ネガティブ染色技術では、スミアは一滴のインディアインクまたはニグロシン懸濁液で作られ、室温で乾燥させた後、光の通過に対して不透明なフィルムを形成します。このように、微生物は暗い背景に明るい形で現れます。

準備

A.スミア

1.-スライドをよく洗い、吸収紙で乾かしてラベルを付けます。ラベルは、準備の内容、日付、およびそれを処理した人の名前を示さなければなりません。

2.-ライターを点火し、炎の接種ループを真っ赤になるまで滅菌します。

3.-ハンドルを冷まします。

4.-細菌培養チューブを取り、キャップを外し、すぐにチューブの口をバーナーの炎（炎）の近くに通します。

5.-接種ループを細菌培養物を含むチューブに挿入し、サンプルを採取します。

6.-培養液が液体培地の場合は、取っ手で取ったサンプルをスライドの中央に置き、直径約2 cmの円に注意深く広げます。

7.-接種ループを再度滅菌します。

8.-塗抹標本を空気中で乾燥させます。

9.-手順3〜8を3回繰り返します。

10.-培養液が固形培地である場合は、あらかじめ蒸留水をスライドに滴下する必要があります。これは、ステップ2〜5（無菌条件）の指示に従って、接種ループで採取した培養物の少量サンプルを混合するために行われます。

11.-希釈したサンプルをスライドに水滴で広げ、3回繰り返します。

B.固定

1.- 2滴のメタノールまたは無水エタノールを、乾燥培地に-液体培地での培養物から-加えます。

2.-ライターから離れて空気乾燥させます。

3.-塗抹標本が固体培地の培養に由来する場合、乾燥した塗抹標本は熱で固定され、軽い炎の最も熱い部分をすばやく2〜3回通過します。

4.-塗抹標本の下部を左手の背側の部分で触れ（右利きの場合は右手で使用します。それ以外の場合は右手を使用します）、冷たいことを確認します。

C.簡単な染色

1.-選択した染色液2滴を塗抹標本に加え、染色ごとに特定のプロトコルで必要な時間（通常1〜5分）そのままにしておきます。

2.-一部の汚れは、活性化に熱を使用する必要があります。その場合、スライドを軽い炎で加熱するときは非常に注意する必要があります（ピンセットで操作し、沸騰を避けます）。塗抹標本を過熱すると、観察される細胞を破壊する可能性があります。

3.-ピケットから蒸留水で洗浄して、余分な着色剤を取り除きます。作業台の上で傾けて、スライドの端を軽くたたいて洗浄水を除去します。

4.-自然乾燥させます。

5.-観察のタイプに応じて、この段階ではカバースリップが使用されているか、使用されていません。カバーガラスは塗抹標本を保護し、保存します。この段階で油浸観察を行うと、カバーガラスは使用されませんが、塗抹標本を保存することはできません。

D.塗抹標本の確実な保存

1.-塗抹標本を以下に示す各溶液に最低5分間連続して浸します。これらの「バス」の目的は、塗抹標本を完全に脱水することです。スメアを次のバスに導入する前に、各試薬を完全に排出する必要があります。

脱水槽の順番は次のとおりです。

1. エタノール70％
2. エタノール95％
3. 純粋なアセトン
4. アセトン-キシロール1：1混合物
5. キシロール

次に、空気乾燥させます。

2.-カナダのバルサムまたは他の封入剤を使用して、カバースリップを、できれば22×22 mmに取付けます。

参考文献

1. Briggs、G.（1965）。微生物検査室の事故と感染の原因因子。米陸軍生物学研究所。フォートデトリック。
2. Cappucino、JG and Welch、CT（2017）。微生物学：実験室マニュアル。ピアソン。
3. Holt、JGエディター。（1977）。より短いBergey's Manual of Determinative Bacteriology。8 ^番目のボルチモア：ウィリアムズとウィルキンス社
4. ジョンソン、TRおよびケース。CL（2018）。微生物学における実験室実験。ピアソン。
5. Tille、P.（2017）。診断微生物学。14 ^番目の Elsiever社：セントルイス、USA