グラム染色：理論的根拠、材料、技術および用途 - 生物学 - 2025

グラム染色は、最も簡単で便利である染色診断微生物学における技術。この手法は、1884年にデンマーク人の医師であるハンスクリスチャングラムが作成しました。

この手法は、試薬を安定させて染色の品質を向上させるために、1921年にハッカーによって特定の変更が加えられました。そのため、グラム染色はグラムハッカーとしても知られています。

さまざまな塗抹標本がグラム染色で染色されました。A.グラム陽性球菌。B.グラム陰性桿菌。C.グラム陽性、多形核および単核桿菌。D.酵母。

この技術を使用すると、微生物の形状を観察することもできます。つまり、微生物が球菌、桿菌、球菌、多形、繊維状などの場合です。空間での分布だけでなく、クラスター内、チェーン内、孤立、ペア、テトラッドなどで。

細菌感染が疑われる場合は、受け取ったサンプルのほとんどをスライドに塗り、顕微鏡検査のためにグラム染色します。

グラムレポートは、最終的な培養結果を取得する前に、感染の原因となる可能性がある微生物の種類について医師をガイドします。

場合によっては、患者の生活が非常に損なわれるため、医師は微生物の同定を待つ間、経験的治療を行うために緊急にグラムレポートを必要とします。

たとえば、グラムが脳脊髄液にグラム陽性球菌があることを明らかにした場合、医師は、確立されたプロトコルに従って、この種の細菌を排除する抗生物質による初期治療を指導します。

分離された微生物の名前とそれぞれの抗生物質の名前が記載された最終結果が到着すると、医師は治療法を変更するかどうかを評価します。この決定は、彼が受け取っている抗生物質に対する微生物の感受性と患者の進化の研究に基づいて行われます。

基礎

これは、染色、媒染剤による固定、変色、および対比染色という4つの基本的なステップがある手法です。したがって、この手法では、細菌を着色するだけでなく、細菌を区別することもできます。

クリスタルバイオレットは最初に使用された着色剤です。それはペプチドグリカンに親和性があり、すべての細菌を紫色に染色し、次にルゴールが配置され、媒染剤として機能します。つまり、不溶性のクリスタルバイオレット-ヨウ素複合体-細胞内のリボ核タンパク質の形成を誘導します。 。

ペプチドグリカンの厚い壁を持つグラム陽性菌は、より多くの複合体（クリスタルバイオレット-ヨウ素）を形成するため、色素を保持します。

さらに、グラム陽性菌の壁には不飽和酸が多く含まれ、酸化剤（Lugol）に高い親和性を示すことにも影響します。

一方、グラム陰性菌はペプチドグリカンの薄層を持っているため、細菌はグラム陽性菌よりも複合体を形成しません。

次に、変色ステップが始まります。ここでは、グラム陽性菌とグラム陰性菌の挙動が異なります。

グラム陰性菌は、細胞壁の一部であるリポ多糖が豊富な外膜を含んでいます。脂肪はアセトンアルコールとの接触により破壊されるため、外膜が不安定になり、紫色の結晶が放出されます。

これが、サフラニンまたは基本的なフクシンで対抗され、赤くなった方法です。

グラム陽性菌の場合、ブリーチは毛穴を閉じることによって機能し、クリスタルバイオレット/ヨウ素複合体の漏出を防ぐため、退色に抵抗します。

そのため、クリスタルバイオレットによる着色は安定しており、サフラニンやフクシンの余地はありません。これが、これらのバクテリアが深い青色または紫色に染まる理由です。

材料

グラムの染色セットは以下で構成されます：

• バイオレットグラス
• ルゴル
• アセトンアルコール
• サフラニンまたは基本的なフクシン

染料と試薬の調製

クリスタルバイオレット溶液

への解決策：

バイオレットクリスタル------------- 2 gr

エチルアルコール95％----------- 20cc

ソリューションB：

シュウ酸アンモニウム----------- 0.8 gr

蒸留水------------- 80 cc

クリスタルバイオレットを最終的に調製するには、溶液Aを蒸留水で1:10に希釈し、4部の溶液Bと混合する必要があります。混合物は使用前に24時間保管します。ろ紙を使用して、琥珀色の染色ボトルにろ過します。

毎日使用する量は、琥珀色のドロッパーボトルに転送されます。

ヨードルゴール

次のように、各化合物の指示された量を計量して測定します。

ヨウ素結晶------------- 1gr

ヨウ化カリウム------------- 2gr

蒸留水------------- 300 cc

ヨウ化カリウムは少しずつ水に溶け、ヨウ素が加えられます。溶液を褐色瓶に剃る。

毎日の使用量は、スポイトで小さな琥珀色のボトルに移されます。

漂白

95％エチルアルコール-----------– 50 ml

アセトン------------------ 50 ml

同等品でご用意しております。蒸発する傾向があるため、よく覆ってください。

ドロッパーボトルに入れます。

この準備は適度な時間5-10秒で変色を提供し、最も推奨されます。

初心者は、退色が10〜30秒よりも遅い95％エチルアルコールのみを使用することを好みます。

経験豊富な方は純アセトンを使用できますが、変色は1〜5秒で非常に速く発生します。

コントラスト

サフラニンストックソリューション

サフラニーナ-------------– 2.5 gr

エチルアルコール95％--------– 100 cc

指示された量のサフラニンを秤量した後、それを100mlの95％エチルアルコールに溶解します。

作業用サフラニン溶液はストック溶液から調製されます。

これを行うには、原液10 ccを測定し、蒸留水90 ccを加えて100 mlにします。

毎日の使用量をスポイトで褐色瓶に移すことをお勧めします。

特定の嫌気性菌、レジオネラ属、カンピロバクター属、ブルセラ属などのグラムハッカー染色でグラム陰性を弱く染色する微生物は、グラム・ハッカー染色のコペロフの改変を使用して、よりよく染色できます。グラムコペロフ染色と呼ばれる。

この技法は、サフラニン色素を基本的なフクシンに変更します。この改変により、前述の微生物を効果的に着色することが可能である。

試薬保管

調製した着色剤は室温で保存する必要があります。

着色するサンプルの塗抹標本の準備

塗抹標本で微生物が観察される可能性が高くなる前に、サンプルには少なくとも10 ^5個の微生物が含まれている必要があります。塗抹標本は、直接サンプルから、または固体または液体培地での培養から作成できます。

塗抹標本は、存在する構造をよりよく視覚化するために、均一で、よく分散され、厚すぎない必要があります。

-直接サンプルのグラム

未遠心尿のグラム

尿を混合し、10 µlをスライドに載せます。少なくとも1つの細菌/ Dipフィールドの観察は、感染があることを示します。

これは、培養物が症例の85％で約100,000 CFU / ml（10 ⁵ CFU / mL）を超える尿を含むことを意味します。

この方法は、コロニー数が100,000 CFU未満の場合は役に立ちません。

CSFグラム

CSFを遠心分離し、上澄みを除去し、ペレットをスライドに広げます。この液体は通常の状態では無菌です。細菌の観察は感染を示します。

呼吸サンプルのグラム

さまざまな微生物が存在する可能性がありますが、痰のグラム、気管支または気管支肺胞洗浄は、観察される細胞の種類が有用であることに加えて、常に診断を導きます。

痰の場合、塗抹標本は、サンプルの最も化膿した部分で準備する必要があります。

スツールのグラム

診断値がないため、このタイプのサンプルでグラムを実行することはお勧めしません。

-作物のグラム

これらは、液体培養と固体培養の2つの方法で実行できます。

液体培養

液体培養からそれは非常に簡単です。濁ったブロスのいくつかのローストをバーナーの下で取り、清潔で乾燥したスライドの上に置き、材料を中央から周辺に向かって円運動させ、材料を均一に分散させます。

空中で自然乾燥させます。乾燥したら、材料を熱でシートに固定します。これを行うには、ピンセットを使用して、シートをブンゼンバーナーの炎に3〜4回通します。

シートを冷まし、カラーリングブリッジに置きます。

固形作物

固形培養からグラム染色の塗抹標本を作成するには、次の手順に従います。

採取するコロニーを選択する前に、スライドを準備し、滅菌生理食塩水を約2滴入れます。

元の培養プレートにいくつかの異なるタイプのコロニーが含まれている場合は、それぞれの隔離されたコロニーがグラムを実行するために選択されます。各コロニーはプラチナループで採取され、前にスライドに置かれた生理食塩水に溶解します。

スライド上のコロニーを均一に分散させるために、中心から周辺に向かって円運動が行われます。

空中で自然乾燥させます。乾いたら、先に説明したように（スライドをライターで燃やすことにより）シートを熱で固定し、材料を焦がさないように注意します。

この手順は、異なるタイプのコロニーごとに行う必要があります。一枚の紙の上で、観察されたものの順番に注意してください、例えば：

コロニー1：ベータ溶血性黄色コロニー：グラム陽性球菌がクラスターで観察された

コロニー2：溶血のないクリーム色のコロニー：グラム陰性球菌が観察された。

私たちが観察しているものを知るために、各スライドにはラベルを付ける必要があります。

技術

グラム染色技術は、実施が非常に簡単で、比較的安価で、微生物学研究室では見逃せません。

これは次のように行われます。

1. スミアを熱で固定し、染色ブリッジに置きます。
2. スライドをクリスタルバイオレットで1分間完全に覆います。
3. 水で洗い流す 乾燥させないでください
4. ルゴール溶液でシートを覆い、1分間作用させる。水で洗い流す 乾燥させないでください。
5. アルコールアセトンで穏やかに振とうしながら5〜10秒間漂白します。または、シートを縦向きに置き、表面に脱色剤を滴下して、保持されていないすみれ色のガラスが取り除かれます。超えないでください。
6. 水で洗い流す 乾燥させないでください。
7. 染色ブリッジ上のスライドを交換して、30秒間サフラニン（グラムハッカー）でカバーするか、1分間ベーシックフクシン（グラムコペロフ）でカバーします。
8. 水で洗う
9. 自然に直立させて自然乾燥させます。

乾いたら、1滴のイマージョンオイルを置いて、100倍の対物レンズの下で光学顕微鏡で観察します。

ユーティリティ

この技術は、ほとんどの細菌の形態形成の違いを区別することができます。

酵母もこの色で区別されます。彼らはクリスタルバイオレットを取る、つまり、グラム陽性染色します。

一方、芽胞はよく染色されないが、芽胞が形成された細菌内に明確な空間が観察される、芽胞形成グラム陽性桿菌を区別することができる。Shaeffer-Fultonのような他の技術は胞子を染色するために使用されます。

この染色は、すべての種類の細菌を着色するために使用されるわけではないことに注意してください。つまり、染色が機能しない場合があります。

この場合、細胞壁を欠く細菌が挙げられます。例：マイコプラズマ属、スフェロプラスト、ウレアプラズマ、L-フォームおよびプロトプラスト。

また、マイコバクテリアなどのミコール酸が豊富な壁や非常にひどいバクテリア、クラミジアやリケッチアなどの細胞内バクテリアも染色します。

また、ほとんどのスピロヘータ細菌の染色には効果がありません。

グラム陽性菌およびグラム陰性菌と同じサンプルで観察できる同じ属の細菌があります。これが発生すると、可変グラム染色と呼ばれます。これは、栄養素、温度、pH、または電解質濃度の変化が原因である可能性があります。

よくある間違い

誇張された漂白

変色工程での誇張は、偽のグラム陰性微生物の観察につながる可能性があります。

液浸油を追加するのに十分な乾燥時間を待たない

グラム陽性菌にグラム陰性菌（偽グラム陰性菌）を染色させる可能性があります。これは、古い培養では細菌が死んでいるか、または腐敗している可能性が高く、これらの条件下では細菌がクリスタルバイオレットを保持しないためです。

非常に古いルゴール溶液を使用してください：

時間の経過とともに、ルゴールはその特性を失い、色が薄くなります。既に変性した試薬を使用した場合、クリスタルバイオレットが十分に固定されないため、偽陰性のグラム陰性菌を可視化できる可能性があります。

青色背景

適切に変色した背景は赤になります。青色の背景は、変色が不十分であったことを示します。

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