ライトの染み：理論的根拠、材料、技法、および用途 - 生物学 - 2025

ライトの汚れは、ロマノフスキー染色に基づいて、1902年にアメリカの病理学者ジェームス・ホーマー・ライトによって作成された染色技術です。ロマノウスキー染色が不安定だったので、ライトは溶媒と固定剤としてメタノールを組み込んだ。

この着色は多色性です。つまり、染料を吸収する構造に応じて、いくつかの色が生成されます。この染色技術は、白血球の分画を行い、末梢血と骨髄の赤血球、血小板、白血球の形態を研究するために広く使用されています。

さまざまな末梢血塗抹標本がライト染色で染色された。A.急性白血病B.赤血球内のマラリア原虫。C.熱帯熱マラリア原虫、大型配偶子母細胞。D.リンパ球

血液のさまざまな細胞株に異常が見られ、白血病や細菌感染症、寄生虫感染症などの病気の診断を容易にするため、その適用は非常に重要です。

おそらくこれらは、この手法が使用される最も一般的なアプリケーションですが、それらだけではありません。また、鼻汁、糞便粘液、痰、皮膚サンプルなど、血液や骨髄以外のサンプルにも役立ちます。

ライトの染みの根拠

ライトの染色は、酸性染料（エオシンY）と塩基性染料（メチレンブルー）のメチルアルコール溶液とそれらの酸化生成物からなるロマノウスキーの染色から生まれました。

ライト染色で使用される染料の混合物は、ロマノウスキーとして知られる効果を引き起こします。つまり、白血球と好中球顆粒の核に美しい紫色の色を与え、赤血球はピンクに染色します。

ライト染色の典型的な色域を与える原因となる成分は、青色BとエオシンYです。観察される効果は、色素の化学構造への結合と青色BとエオシンYの相互作用に依存します。

核酸、核タンパク質、一部の種類の細胞の反応性未熟細胞質などの酸性構造は、ブルーB（基本染色）を修正します。

ヘモグロビンなどの基本的な構造は、他の細胞構造の中でも、セグメント化された好酸球の顆粒がエオシンY（酸性染料）を結合します。

染色結果は、ライト染料のpH、バッファー、洗浄液などのさまざまな要因の影響を受ける可能性があります。だけでなく、染色と固定時間。

したがって、試薬の準備の各ステップは非常に重要であり、細部に注意を払って実行する必要があります。

材料

ライトの染み。100 mLの場合、以下が必要です。

0.3 gのライト染色液を量り取り、97 mlのメタノールと3 mlのグリセロールを測定します。

準備

乳鉢に大量のライトの着色剤を入れ、粉末が完全に溶解するまでグリセロールを徐々に加えます。

続いて、メタノールが添加され、混合され、褐色のボトルに注がれます。

使用する前に、溶液を穏やかな動きで振とうし、ろ過する必要があります。

緩衝液

1リットルの蒸留水に、3.76 gのリン酸水素二ナトリウム（Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ O）と2.1 gのリン酸二水素カリウム（KH ₂ PO ₄）を加えます。

取り込まれた試薬がすべて溶解するまでよく混ぜます。pHを7.2に調整します。ガラス瓶に注ぎ、室温で保管してください。

着色を実行するために必要な追加の材料

さらに、他の材料は、着色技法を実行できるようにするために必要です。これらは、オブジェクトのスライドまたはカバーオブジェクト、着色ブリッジ、洗浄用の水またはバッファー付きのTシャツ、着色時間を維持するためのタイマーおよび一部の乾燥材料です。 （吸収紙、ガーゼまたは綿）。

ライトの染みの成分

メタノール

アルコール（メタノール）は、スライドへの血液塗抹標本の固定液として機能します。

それは基本的に凝固剤の還元、脱水および固定試薬です。したがって、その機能はタンパク質を凝固させて不溶化することですが、実際には変性させません。

メタノールは、エタノールよりも優れた結果が得られるため、すべてのラボで最も広く使用されているスメア固定試薬です。理想的な濃度は99％です。

ダンパー

細胞構造が色素を適切に吸収するには、7.2に調整されたpHが不可欠であるため、バッファー（バッファー溶液）は色素のpHを調整または維持する機能を備えています。

一方、メタノール固定ステップは細胞を脱水し、緩衝液は細胞を再水和するのに役立ちます。

エオシン（Y）

エオシンは酸性染料であるため、ビルディングブロックとの親和性があります。2つのタイプのエオシンは互いに非常によく似ているため、どちらを使用しても同じ結果が得られます。

1つはエオシンY、黄色のエオシン、またはテトラブロモフルオレセインと呼ばれ、もう1つはエオシンB、青みがかったエリスロシンB、またはジブロモジニトロフルオレセインと呼ばれます。ただし、エオシンYが最も一般的に使用されます。

この染料の最も重要な特性は、その負の極性です。これにより、正に帯電した細胞構造に引き付けられます。

メチレンブルー

基本的なカラーリングです。その主な特性は変色症です。つまり、すべての構造が同じ色に染色されるわけではありません。着色する構造の化学組成によって異なります。

一部は明るいまたは濃い青に変わり、一部は濃い紫または淡いライラックに変わります。

技術

1-スライドまたはカバースリップのいずれかに薄膜が残るようにサンプルを広げます。

2-空気中で約2時間乾燥させます。

3-サンプルの広がりが上を向くように染色ブリッジまたは染色トレイに乾燥スミアを置きます。

4-全面を覆うまで、ライトステインを少しずつシートに覆います。5〜8分間そのままにします。

5-汚れがスライドを完全に覆い、縁をこぼさないようにする必要があります。着色時間中に蒸発し始めたら、数滴を追加します。

6-続いて等量のショックアブソーバーを追加し、特徴的な金属の輝きが現れるまで少し吹きます。時間は10〜15分です。

7-水道水で洗い、シートがピンクに見えるまで穏やかな流れを置きます。

8-ガーゼをアルコールに浸し、スライドの裏側に付着した染料を取り除く。

9-顕微鏡下で観察するために、液浸油を配置する前に塗抹標本をよく乾かします。

ユーティリティ

血液学

末梢血塗抹標本の染色、濃厚な血液塗抹標本の検査、および骨髄サンプルからの細胞の研究に最適です。

この色素の組み合わせの化学的性質により、細胞構造を簡単に認識でき、存在するさまざまな種類の細胞を区別できます。

鼻水

この技術は、アレルギー性鼻炎の診断において、鼻汁の細胞（上皮細胞、セグメント化された好酸球、多形核細胞）を識別するのに非常に役立ちます。

寄生虫学

この意味で、それは皮膚潰瘍の皮下細胞組織の組織球内のリーシュマニア種の研究に有用でした。同様に、それは便試料中の白血球を識別するために使用されます（糞便の白血球図）。

この場合、便に存在する白血球増加症が多形核であるか単核であるかを知ることは医師にとって興味深いことです。糞便の白血球のこの所見は、それがそれぞれ細菌感染かウイルス感染かを導きます。

一方、血中を循環している寄生虫は赤血球内に見られるか、血漿中に遊離しています。求められる寄生虫は、プラスモディウム属、トリパノソーマクルジーおよびフィラリアであり、獣医学では、特に馬におけるベベローシスの原因物質であるTheileria equiおよびBabesia caballiの検索に有用です。

ライト染色およびギムザ染色は、血液寄生虫を通常の細胞成分から区別することを可能にします。これには2種類のスプレッドを使用できます。

薄く広がる

血液はスライド上に薄膜として広がります。ライト染色で染色され、核や細胞質の特徴を明らかにします。

厚いドロップ

この方法論は、大量の血液中の寄生虫の存在を調査するために使用されます。

これを行うには、スライドに大滴の血液を置きます。そこに到達したら、別のスライドの端を使用して、中心から外側に向けて徐々に大きくなるように除細動する必要があります。

最後に、濃厚塗抹標本で寄生虫を観察できるようにするには、赤血球を水で溶解する必要があります。

呼吸器感染症

呼吸レベルでは、この手法は有用です。痰、気管支洗浄液、または気管支肺胞のサンプルに存在する細胞は、診断を確立するために重要であるためです。

同様に、多形核細胞と単核細胞はここで区別することができます。

細菌学

細菌学におけるこの手法の使用は制限されています。これは、細菌の染色には適していないため、他の特殊な染色手法が染色に使用される理由です。

しかし、尿道または子宮頸管粘膜塗抹標本でクラミジアトラコマチス封入体を有する上皮細胞を探すために使用されていますが、これが最良の方法ではないことは認識されているはずです。

感染した患者の赤血球間でボレリアバーグドルフェリなどのらせん状の細菌を観察したり、リンパ球、単球、または血液塗抹標本の好中球の細胞質にあるEhrlichia spの桑実胚や封入体を観察したりすることもできます。

菌学

Histoplasma capsulatumは、ライト染色で染色されたさまざまな組織サンプルの顕微鏡観察によって頻繁に診断される病原菌です。

ライト染色で血液サンプルの構造はどのように観察されますか？

出典：Retamales E、Mazo V. Institute of Public Health、チリ政府。ヘモグラムを読み取るための血液塗抹標本の染色に関する推奨事項。

良好な染色に関する推奨事項

血液サンプルのスライドは自然乾燥します。スミアは、染料のより良い固定を得て、過度の染色を避けるために、可能な限り薄くする必要があります。

高品質の染色を行うには、塗抹標本を作製してから2時間以内に染色することをお勧めします。一方、理想的なサンプルは抗凝固剤なしの毛細血管血です。

ただし、静脈血を使用する場合は、ヘパリンは細胞構造を変形させる可能性があるため、ヘパリンではなく抗凝固剤EDTAとして使用する必要があります。

調製した着色剤の劣化を防ぐため、乾燥した場所に保管してください。

洗浄プロセスでは、中性のpHに調整した水の使用をお勧めします。

最後に、実験室で時々使用される染色方法をテストすることをお勧めします。

これは、品質管理として、サンプルまたは拡張パターンを染色することによって行われます。このステップは、染色が適切に準備され、染色時間が十分に標準化されていることを保証するため、重要です。

パターンシートの色が悪い場合は、解決する必要のある問題があります。

ライト染色のよくある間違い

非常に薄い染色

非常に薄いスミアは通常、染色時間が非常に短いか、過度の洗浄が原因です。染料との接触時間を長くするか、洗浄時間を短くすることで修正されます。

着色剤の沈殿物

塗抹標本内の染料の沈殿物の存在にはいくつかの原因が考えられますが、最も一般的な原因は、ろ過されていない染料の使用、不均一な染色ブリッジの染色、ほこりやグリースで汚れたシートの使用、よく洗浄されないことです完全な染色。

非常に赤または青の汚れ

バッファーは色素のpHに関与します。示されている（酸性）pHより低いpHの染料は、非常に赤みがかった汚れになります。

染料のpHが（アルカリ性）を超えると、非常に青みがかった汚れが得られます。

ストレージモード

試薬は室温で保存してください。

参考文献

1. GutiérrezV.ホンジュラスのサンペドロスラ市におけるイヌのエールリヒア症の診断のためのライト染色法とエリザ法の比較研究。2008.獣医学の学位を取得するための学位論文。グアテマラのサンカルロス大学。
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