ZIEHL-NEELSEN染色：理論的根拠、試薬、および手法 - 生物学 - 2025

チール-Neelsen着色技術は、微生物に耐性アルコール酸（ARA）を特定します。この微生物学手順の名前は、その作者である細菌学者のフランツツィールと病理学者のフリードリッヒニールセンを指します。

この手法は、異なる染色の一種であり、観察、識別、および後で識別したい構造間のコントラストを作成するために、異なる染料を使用することを意味します。Ziehl-Neelsen染色は、特定のタイプの微生物を識別するために使用されます。

Ziehl-Neelsen染色

これらの生物のいくつかは、マイコバクテリア（たとえば、Mycobacterium tuberculosis）、ノカルジア（たとえば、Nocardia sp。）、およびいくつかの単細胞寄生虫（たとえば、Cryptosporidium parvum）です。細菌の多くは、グラム染色と呼ばれる一般的な手法で分類できます。

ただし、一部の細菌グループは、それらを識別するために他の方法を必要とします。Ziehl-Neelsen染色などの手法では、前者を細胞壁に固定するために染料と熱を組み合わせる必要があります。

次に、2つの結果を可能にする漂白プロセスがあります：酸とアルコールによる変色への耐性または感度。

基礎

この染色技術の根拠は、これらの微生物の細胞壁の特性に基づいています。壁はミコール酸と呼ばれる種類の脂肪酸で構成されています。これらは非常に長い鎖を持つことを特徴としています。

脂肪酸の構造が非常に長いと、染料を保持しやすくなります。一部の細菌属は、細胞壁内のミコール酸の含有量が高いため、グラム染色では染色が非常に困難です。

Ziehl-Neelsen染色剤は、基本的な染色剤であるフェノール化合物のカーボフクシンを使用します。これは細胞壁の脂肪酸と相互作用する能力があり、室温ではテクスチャーがワックス状です。

ワックスが溶けて染料分子がより速く細胞壁に移動するため、熱が存在するとカルボフクシン染色が強化されます。

後で使用される酸は、壁が色素と十分に関連していなかったために染色されなかった細胞を変色させる働きをします。したがって、酸性漂白剤の強度は酸性染料を取り除くことができます。この変色に抵抗する細胞は抗酸と呼ばれます。

二次着色剤

サンプルの脱色後、二次染料と呼ばれる別の染料と対照的です。一般的にメチレンブルーやマラカイトグリーンが使われます。

二次染料は、背景素材を染色し、その結果、最初のステップで染色された構造とのコントラストを作成します。変色した細胞だけが2番目の色素（対比染色）を吸収してその色を帯びますが、抗酸細胞は赤い色を保ちます。

この手順は、抗酸菌と呼ばれる結核菌とらい菌の同定によく使用されます。

試薬

一次着色剤

0.3％カルボフクシン（ろ過済み）を使用。この染料は、アルコールの混合物から調製されます：フェノールのエタノール溶液（90％）またはメタノール（95％）、およびこの混合物に3グラムの塩基性フクシンが溶解されています。

漂白剤

このステップでは、3％アルコール酸または25％硫酸の溶液を使用できます。

二次染料（カウンターダイ）

サンプルを対比するために最も使用される染料は、通常0.3％メチレンブルーです。ただし、0.5％マラカイトグリーンなど、他のものも使用できます。

技術

抗酸染色手順

細菌塗抹標本を準備する

この準備は、無菌予防策に従って、清潔で乾燥したスライド上で行われます。

スミア乾燥

塗抹標本を室温で乾燥させます。

サンプルを加熱する

下のスライドに火を当ててサンプルを加熱します。塗抹標本が唾液で調製されていない場合（次亜塩素酸ナトリウムで処理して白くする）、およびすぐに染色されない場合は、アルコール固定を行うことができます。

結核菌は、漂白剤と染色工程で除去されます。アルコール固定は殺菌性であるが、未処理の痰の熱固定は結核菌を殺さない。

汚れを覆う

汚れは、カーボルフクシン溶液（一次基本汚れ）で覆われています。

汚れを温める

これは5分間行われます。蒸気の発生に気付くはずです（約60°C）。サンプルを過熱させないように注意してください。

染色剤の加熱に関しては、特に前の染色からの引火性の高い化学物質が収集されたトレイまたはその他の容器で染色を行う場合は、カルボフクシンを加熱する際に細心の注意を払う必要があります。

数滴の酸性アルコール、メタノールまたは70％エタノールで湿らせた、以前に点火した綿棒を使用して、スライドの下に小さな炎だけを当てます。エタノールに浸した大きな綿棒は、火災の危険があるため使用しないでください。

汚れを洗います

この洗浄はきれいな水で行う必要があります。水道水がきれいでない場合は、できればろ過水または蒸留水で塗抹標本を洗ってください。

酸性アルコールで塗抹標本を覆う

この酸性アルコールは3％である必要があります。塗布は5分間、または塗抹標本が十分に変色するまで、つまり淡いピンク色になるまで行います。

酸性アルコールは可燃性であることを考慮する必要があります。したがって、慎重に使用する必要があります。発火源の近くに近づかないでください。

汚れを洗います

洗浄は、きれいな蒸留水で行う必要があります。

汚れを汚れで覆います

塗抹標本が薄い場合は、より長い時間を使用して、マラカイトグリーン（0.5％）またはメチレンブルー（0.3％）で1〜2分間染色できます。

汚れを洗います

再びきれいな（蒸留された）水を使用する必要があります。

垂れ流す

スライドの裏側を清掃し、汚れを排水ラックに置いて自然乾燥させます（乾燥に吸収紙を使用しないでください）。

顕微鏡下で塗抹標本を調べる

100X対物レンズと液浸油を使用する必要があります。体系的に塗抹標本をスキャンし、関連する観察を記録します。

結果を解釈する

理論的には、赤味を帯びた微生物は抗酸陽性（AAR +）と見なされます。

反対に、微生物が青または緑に染まる場合、対抗染料として使用される染料に応じて、それらは抗酸陰性（AAR-）と見なされます。

参考文献

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