免疫蛍光は、共有結合固体支持体上に固定された細胞試料中の特定の標的を同定するために蛍光分子に結合した抗体を用いた免疫染色強力な技術です。
この技術は、免疫学的特異性を備えた顕微鏡観察を含み、微量の抗原を提示できる生細胞または死細胞を観察することを可能にします。これは、研究の分野とさまざまな病状の臨床診断の両方で広く使用されています。
心筋細胞におけるアクチンフィラメントの免疫標識（出典：Wikimedia Commons経由のPs1415）
この手法は、主に定性的（一部の定量的バリアントを使用）であり、抗体に結合した蛍光分子であり、特定の波長で励起できるフルオロフォアの生成物信号によるサンプルの視覚化に特に関係しています。 。
細胞の状況では、タンパク質の存在/非存在と細胞内位置を研究することは非常に有用です。この手法は、インフルエンザなどのウイルスを診断するための臨床現場で最初に使用され、その後、他の多くの感染症で使用されました。
これは非常に感度の高い技術であり、適切な顕微鏡装置があれば、非常に優れた解像度を実現できます。その観察には、共焦点顕微鏡または落射蛍光顕微鏡の使用が必要です。
ただし、非常に人気があるにもかかわらず、バックグラウンドの「ノイズ」を生成する非特異的な蛍光の取得に関して、いくつかの重要な問題が発生する可能性があり、結果の適切な読み取りが制限されることがよくあります。
基礎
免疫蛍光は、抗体と抗原間の相互作用反応の生物学的現象の利用に基づいています。蛍光分子を特定の波長に励起することにより、この反応の可視化または検出を特に行う必要があります。
抗体は、アクティブなB細胞から分泌される免疫グロブリンタンパク質で、抗原に対して特異的に生成され、高い親和性と特異性で結合できます。免疫蛍光は、IgG免疫グロブリンを利用します。IgGは、血清に溶解します。
抗体は、2つの短い（軽い）と2つの長い「Y」字型（重い）ペプチド鎖で構成される、最大950 kDaの分子です。軽鎖と重鎖の両方が2つのドメインに分かれています。1つは抗原を認識できる変数で、もう1つは各種に固有の一定または保存された特性です。
抗原は、抗体によって認識できる分子として機能的に定義されており、ほとんどの場合、タンパク質です。動物が抗原にさらされると、免疫系のリンパ球が活性化され、それに対する特異的な抗体を産生し、防御系として機能します。
例えば、タンパク質などの抗原は、抗体による複数のエピトープまたは認識部位を有する場合があり、したがって、抗原に曝露された動物の血清は、同じタンパク質の異なる領域に対するポリクローナル抗体を有する場合がある。
次に、免疫蛍光法は、動物を精製して特定の抗原に対するポリクローナル抗体を生成する能力を利用して、それを精製し、その後、他の状況で同じ抗原の検出に使用します。
一部の免疫蛍光法で最も使用される蛍光色素または分子には、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート-5および6（TRITC）、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7などの多くのシアニン、およびAlexaFluor®と呼ばれる色素があります。 、AlexaFluor®448など。
プロトコル
免疫蛍光プロトコルは多くの要因に応じて異なりますが、一般的な用語では、以下からなる直線的な一連のステップが含まれます。
- プレートと細胞の準備
- サンプルの固定
- 透過処理
- ブロッキング
- 免疫染色または免疫染色
- 組み立てと観察
-準備
サンプルの
サンプルの準備は、サンプルの性質と実行する経験のタイプによって異なります。懸濁液中の細胞の使用を含む最も単純なケースを以下に説明します。
懸濁液中の細胞、つまり液体培養液中の細胞は、まず遠心分離によって細胞から分離し、次に完全性を保つ緩衝液または等浸透圧「緩衝液」で洗浄する必要があります。
通常、PBSとして知られているリン酸生理食塩水バッファーが使用されます。このバッファーでは、細胞が再懸濁され、この混合物が再び遠心分離されて、干渉物質を含む可能性のある培養液を含まない細胞が得られます。
ブレードの
顕微鏡観察に使用されるスライドは、対応する下流の処理のために後で細胞が固定されるため、注意深く準備する必要があります。
これらは、それらのアミノ基の正電荷と細胞との間の静電相互作用のおかげで、細胞と固体支持体との間の「分子接着剤」として機能する合成ポリマーであるポリリジンの溶液で覆われるか「感作」されます。細胞を覆うタンパク質の負電荷。
サンプルの固定
このプロセスは、空間的な位置をそのまま維持するために、細胞内で見つかったタンパク質を固定化することで構成されています。使用する分子は、すべてのタイプの細胞膜を通過し、共有結合タンパク質と格子を形成できなければなりません。
ホルムアルデヒドとパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、さらにはメタノールも広く使用されており、細胞サンプルを一定時間インキュベートした後、浸透圧緩衝液で洗浄します。
細胞を固定した後、それらは以前にポリリジンで感作されたシートに付着し続けます。
透過処理
実行されるテストのタイプに応じて、研究中の細胞を透過処理するかどうかが必要になります。求められているのが細胞表面上の特定のタンパク質の位置、存在または不在を知ることである場合、透過処理は必要ありません。
一方、細胞内のタンパク質の位置を知りたい場合、透過処理は不可欠であり、細胞膜を透過処理することができる洗剤であるTriton X-100でサンプルをインキュベートすることから成ります。
ブロッキング
すべての免疫学的手法における基本的なステップはブロッキングです。手順のこの段階で、ブロッキングは、細胞が付着しなかったポリリジン分子ですべての部位を感作シート上で覆うことで構成されます。つまり、非特定の結合を防止します。
通常、PBSバッファーにウシ血清アルブミン（BSA）を含む溶液がブロッキングに使用され、この溶液でのインキュベーション時間が長いほど最良の結果が得られます。ブロッキングを含む各ステップの後、残りの溶液を洗い流す必要があります。
免疫染色または免疫染色
免疫染色または免疫染色の手順は、主に直接または間接の免疫蛍光法によって異なります（以下を参照）。
それが一次または直接免疫蛍光法である場合、サンプルは、蛍光色素に結合する必要のある所望の抗体とインキュベートされます。インキュベーション手順は、BSAも含むが、比率が低い溶液で抗体を希釈することから成ります。
二次または間接免疫蛍光の場合は、2回の連続インキュベーションを行う必要があります。最初に所望の抗体で、次に一次免疫グロブリンの定常領域を検出することができる抗体で。フルオロフォアに共有結合しているのはこれらの二次抗体です。
この手法は非常に用途が広く、直接免疫蛍光法の場合、異なる蛍光色素分子に結合した一次抗体がある限り、サンプルごとに複数の抗原を同時に標識できます。
間接免疫蛍光法で同時に標識するためには、各一次抗体が異なる動物で生成されること、および各二次抗体が異なるフルオロフォアに結合していることを確認する必要があります。
ブロッキングと同様に、抗体とのインキュベーションは、この時間が長いほど良い結果をもたらします。各ステップの後、サンプルに結合しなかった過剰な抗体を洗い流す必要があり、二次免疫蛍光法では、二次抗体を加える前にブロックする必要があります。
特定の手法では、DAPIフルオロフォアによる核DNAの染色など、免疫染色に関連しない他の染色を使用します。
組み立てと観察
フルオロフォアとの最後のインキュベーション時間中、サンプルは暗所にとどまる必要があります。顕微鏡下での観察では、抗体に結合したフルオロフォアの蛍光を維持するためにいくつかの物質を使用するのが一般的です。
タイプ
直接的および間接的免疫蛍光の図式的要約（出典：Wikimedia Commons経由のWesthayl618）
直接または一次免疫蛍光
それは蛍光抗体の使用による抗原の検出と関係があります。この手法を使用する主な利点はその速度ですが、非常に不均一な抗体が豊富であるため、特に人間の血清を研究する場合、非特異的結合の多くのケースがプロセスで発生する可能性があります。
間接または二次免疫蛍光
これは「サンドイッチ」技法としても知られ、これには2つのステップでの技法の開発が含まれます。1つ目は、非蛍光抗体の使用と、目的の抗原への結合です。
この一次抗体の定常領域（これは抗原として機能する）に対して、それを認識することができる二次抗体が使用され、これは蛍光分子と関連している。
蛍光シグナルの出現は、最初の非蛍光抗体と目的の抗原との間の特異的認識の結果です。この一次抗体の存在は、標識された二次抗体の状態を調整します。これにより、抗原の有無を確認できます。
直接免疫蛍光法よりもはるかに時間のかかる手法ですが（1つのインキュベーションステップが含まれるため）、この手法は、研究対象の各抗原に対する蛍光抗体の設計を含まないため、経済的には、より実行可能。
さらに、複数の二次抗体が一次抗体の定常領域に結合し、蛍光シグナルの強度を増幅する可能性があるため、信号増幅の点でより感度の高い手法です。
用途
前述のように、免疫蛍光法は非常に用途の広い技術であり、科学および臨床の分野で多くの方法で使用されています。これは、多くの生物に関する生態学的、遺伝的、生理学的な質問への回答に使用できます。
臨床応用の中で、それは研究された患者の上皮組織の直接的または間接的免疫蛍光法を使用して、いくつかの皮膚科疾患の直接診断に使用されます。
免疫蛍光技術は、酵母などの単細胞生物で、核内および細胞質の微小管、アクチンと関連タンパク質、10 nmフィラメント、および細胞質、膜、細胞壁の他の構成要素を視覚化するために利用できます。
参考文献
- アブカム、免疫細胞化学および免疫蛍光プロトコル。abcam.comから取得
- グレフ、C。（2012）。蛍光染料。leica-microsystems.comから取得
- Miller、DM、およびShakest、DC（1995）。免疫蛍光顕微鏡法。Methods in Cell Biology（Vol。48、pp。365–394）。Academic Press、Inc.
- Odell、ID、&Cook、D.（2013）。免疫蛍光技術。Journal of Investigative Dermatology、133、1–4。
- Princle、BJR、Adams、AEM、Druain、DG、およびBrian、K。（1991）。酵母の免疫蛍光法。Methods in Enzymology（Vol。194、pp。565–602）。Academic Press、Inc.
- Schaeffer、M.、Orsi、E. V、&Widelock、D.（1964）。公衆衛生ウイルス学における免疫蛍光の応用。細菌学的レビュー、28（4）、402–408。
- Vrieling、EG、およびAnderson、DM（1996）。植物プランクトン研究における免疫蛍光：応用と可能性。 J：フィコール。 、32、1〜16。