オキシダーゼテスト：理論的根拠、手順、および使用 - 生物学 - 2025

オキシダーゼ試験は、診断法であることを示している酵素複合体と呼ばれるチトクロームオキシダーゼcの存在。このシステムは、酸素を捕捉し、これが呼吸鎖の最後の電子受容体（H ⁺）として機能するため、還元型から酸化型への変換を誘導します。

オキシダーゼという用語は、インドフェノールオキシダーゼとしても知られている酵素チトクロームオキシダーゼを指す省略表現です。古代には、酵素チトクロームオキシダーゼとインドフェノールオキシダーゼは2つの異なる酵素であると信じられていましたが、今日ではそれらは同じであることが知られています。

陽性および陰性オキシダーゼ試験。出典：機械可読の著者は提供されていません。Alpha.prim〜commonswikiを想定（著作権の主張に基づく）。

彼らの側では、チトクロームは鉄を含み、チトクロームオキシダーゼシステムを完成させるヘムタンパク質です。シトクロムは種によって異なります。

シトクロムにはさまざまな種類があります（シトクロムa1、a2、a3、0）。一部の細菌は1つだけを生成できますが、他の細菌は一度に2つまたは3つまで生成します。この意味で、シトクロムaおよびa3の存在はシトクロムオキシダーゼcとして知られています。これは、オキシダーゼテストで検出されるシトクロムのタイプです。

ナイセリア属とシュードモナス属には、チトクロームオキシダーゼcが含まれています。これらの属は陽性のオキシダーゼテストを提供し、それらをそれぞれアシネトバクター属およびステノトロホモナス属と区別するのに役立ちます。

オキシダーゼ陽性である他の属もあります。

基礎

チトクロームオキシダーゼcシステムの特徴

シトクロムオキシダーゼcシステムは次のように機能します。オキシダーゼ陽性微生物は酸素を使用して、好気性呼吸によりエネルギーを生成します。このシステムは、NADH ⁺などのドナー物質から受容体物質（この場合は酸素）への電子輸送のおかげで機能します。

これにより、微生物が持つチトクロームオキシダーゼシステムに応じて、エネルギー（ATP）と水または過酸化水素が生成されます。

この物質が細菌に有毒であるため、ほとんどのオキシダーゼ陽性細菌はカタラーゼ陽性でもあり、生成された過酸化水素を除去するために必要な条件です。

シトクロムオキシダーゼcシステムは、一部の好気性細菌、一部の通性嫌気性菌、いくつかの微好気性菌に存在し、厳密な嫌気性菌には存在しません。厳密な嫌気性菌は酸素の存在下では生存できないため、後者は理解できます。したがって、シトクロムオキシダーゼシステムがありません。

試験原理

このテストでは、人工の電子受容体として機能する物質を使用し、電子輸送チェーン内の天然のものを置き換えます。

主に、パラフェニレンジアミンやインドフェノールなどの色素が使用され、受容体基質および人工電子供与体として機能します。

パラフェニレンジアミンはチトクロームオキシダーゼcシステムによって酸化されます。還元された形の染料は無色ですが、酸化された形の染料は着色されています。

これは、シトクロムオキシダーゼcシステムの存在がどのように証明されるかです。陽性反応は、使用する試薬によってラベンダー色または青紫色を生成するためです。

一方、呼吸鎖の最後の電子受容物質が酸素と異なる場合、オキシダーゼテストは陰性になります（発色はありません）。これは嫌気性微生物の場合です。

同様に、微生物が使用するチトクロームがチトクロームオキシダーゼcと異なる場合も、陰性の結果が得られます。

処理する

オキシダーゼテストには、同じ目的のためのさまざまな試薬とプロトコルがあります。

試薬

Kovacs試薬、GordonおよびMcLeod試薬、Nadi試薬、Carpenter、SuhrlandおよびMorrison試薬、およびオキシダーゼディスクの使用。

-Kovacsオキシダーゼ試薬

それは1％のテトラメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩で構成されています。

コバックスの試薬は、上記物質1gを蒸留水50mlに溶解して調製した。完全に溶けるまで微熱します。十分な容量の琥珀色のボトルに移し、蒸留水で容量を100 mlにします。15分以上待ってから使用してください。光から保護された冷蔵庫に保管してください。

これは、インドールテストを明らかにするために使用されるKovacs試薬と区別するために、Kovacsオキシダーゼ試薬とラベル付けされています。この試薬は、他の試薬よりも感度が高く、毒性が低く、高価です。

陽性反応は、コロニーの色がラベンダーに変化するこの試薬で証明されます。ラベンダーは急速に紫色に近く、ほぼ黒色になります。コロニーに色の変化がないか、わずかにピンクがかった色になるため、否定的な反応が見られます。培地も暗くなる可能性がありますが、それは肯定的な反応を意味するものではありません。

この試薬では、反応時間が非常に重要です。5〜15秒の間に発生する色の変化は、陽性反応と見なされます。

-ゴードンとマクロード試薬

これは、N-ジメチル-p-フェニレンジアミンまたはp-アミノジメチルアニリン一塩酸塩としても知られているジメチル-p-フェニレンジアミン二塩酸塩で構成されています。関与する物質の代わりに、Kovacsオキシダーゼ試薬について説明したように調製されます。

この試薬は、Kovacsオキシダーゼ試薬よりも少し安定していますが、p-フェニレンジアミンを含むすべての試薬は不安定です。

この反応は後であり、10〜30分以内に青紫色の外観を示す陽性と解釈されます。

-ナンディ試薬

これは、エチルアルコール（95％エタノール）中の1％α-ナフトールと1％アミノジメチルアニリンで構成されています。混合物は等量で調製され、100 mlに十分な量になるまで、希釈剤として無水エチルアルコールを使用します。

-カーペンター、スーランド、モリソン試薬

それは1％のp-アミノジメチルアラニンシュウ酸塩で構成されています。Kovacsオキシダーゼ試薬について説明したのと同じ方法で準備し、対応する物質に変更します。

準備が整った溶液を使用して、テストストリップを次のように準備します。

それらは、金属と接触することなく乾燥し、乾燥剤を入れたねじ付きの瓶に保管し、冷蔵庫に保管します。これらのストリップは最大6か月間安定しています。

これは、上記の中で最も安定した試薬であり、溶液中で最長6か月間持続します。もう1つの利点は、プレート上で直接使用した場合、コロニー周辺の培地を着色しないことです。

赤い色の出現は、陽性の検査と解釈されます。

-オキシダーゼディスク

これらは、オキシダーゼテスト用の試薬が含浸された市販のディスクです。市場にはいくつかの商用ブランドがあります。

新しい試薬を準備する必要がないため、その使用は非常に実用的であり、作業を容易にします。得られた結果は、ディスクが適切に保存されている限り信頼できます。

プロトコル

直接プレート法、紙上間接法、オキシダーゼ試薬を含浸させたディスクの使用。

-ダイレクトボード方式

この目的のために、グルコースを含まない培地のプレートに含まれるコロニーに直接、上記の試薬のいずれかを2滴または3滴加えます。

コロニーの色の変化の有無は媒体ではなく解釈されます。有効な反応時間は、使用する試薬によって異なります。

-紙の上の間接的な方法

ろ紙（Whatman No. 1）を6 cm ^2のサイズにカットし、空のペトリ皿の中に置きます。

紙の上に2〜3滴のKovacsオキシダーゼ試薬を加え、プラチナハンドルまたは木製のつまようじでコロニーの一部を調べ、試薬を含浸させた紙の上にまっすぐに広げます。5〜10秒以内に解釈します。

Carpenter、Suhrland、およびMorrison試薬で調製したストリップを使用して、コロニーを乾燥したストリップに広げます。1つのストリップを使用して、いくつかの株をテストします。10秒で解釈

-ディスク（m

市販のディスクを滅菌蒸留水で微かに湿らせ、研究するコロニーに重ねます。35°Cでプレートを使用することをお勧めします。室温のプレートまたは冷蔵プレートを使用する場合、反応は少し遅くなります。10〜20秒の色の変化を解釈します。

血液またはチョコレート寒天に含まれるコロニーを使用できます。

-ディスク（間接的な方法）

前述のようにディスクを湿らせます。空のペトリ皿に入れます。プラチナの取っ手または木製のつまようじで研究するのに十分な量のコロニーを取り、ディスクに置きます。10〜20秒の色の変化を解釈します。

使用する

ナイセリア属とアシネトバクター属は形態学的に非常に類似していることがあります。これは、アシネトバクター属がグラム陰性桿菌である場合でも、球菌型を取り、ペアで分布し、ナイセリア属をシミュレートできるためです。

この場合、オキシダーゼテストは本当に便利です。ナイセリア属は陽性、アシネトバクターは陰性です。

しかし、モラクセラ属はナイセリア属と非常によく似ており、どちらも陽性反応を示します。これが、炭水化物発酵試験を確実に行うために常に実施しなければならない理由です。

一方、オキシダーゼ検査は、腸内細菌科に属する細菌（すべてオキシダーゼ陰性）を、パスツレラ属、エアロモナス属、プレシオモナス属（オキシダーゼ陽性）などの他の発酵槽と区別するのに役立ちます。

ビブリオ属とヘリコバクター属もオキシダーゼ陽性です。

QA

大腸菌の既知の株を陰性対照として、緑膿菌の株を陽性対照として使用します。

制限事項

-試薬は新しく調製して使用する必要があり、非常に不安定であるため、室温での溶液中での保存期間は短いです。彼らは5日から2週間の間続くことができる冷蔵。

-試薬は無色です。色が変わった場合は廃棄してください。損傷したディスクは、時間とともに暗くなるため表示されます。

-コバックスオキシダーゼ試薬による15〜60秒の陽性反応は遅延反応と見なされ、60秒後は陰性反応と見なされます。

-Haemophylus influenzaeは、ジメチル-p-フェニレンジアミンを含む試薬を使用すると陰性のオキシダーゼ反応を示しますが、Kovacsオキシダーゼ試薬（テトラメチル-p-フェニレンジアミン）を使用すると陽性になります。

-グルコースを含む培地はテストを妨害し、偽陰性を与えます。

-Bordetella pertussis株は、高濃度の血液寒天プレートからのものである場合、偽陽性反応を引き起こす可能性があります。

-金属（鉄）ハンドルを使用すると、誤検知が発生します。

推奨事項

-試薬は非常に不安定で自己酸化する傾向があるため、1〜2 mlのアリコートを凍結し、必要に応じて取り除くことをお勧めします。

-試薬の自動酸化を遅らせる別の方法は、試薬の調製時に0.1％アスコルビン酸を追加することです。

-試薬が不安定であるため、毎週の品質管理をお勧めします。

・品質管理試験に合格しない試薬は使用しないでください。

参考文献

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