ギムザ染色：理論的根拠、材料、技術、および用途 - 生物学 - 2024

ギムザ染色は、酸性および塩基性染料の混合物に基づいて、臨床試料を着色するタイプです。その創作は、ロマノフスキーが行った研究に触発されたもので、元々はドイツ出身の化学者であり細菌学者であるグスタフギエムサが、グリセロールを添加して化合物を安定化させることで完成させました。

元のロマノウスキー法に加えられた変更により、顕微鏡観察が大幅に改善されたため、ギムザ染色の名前でバプテスマが施されました。

ギムザ染色されたさまざまなサンプル。A.末梢血中のトリパノソーマエヴァンシ。B.正常な血液細胞。C.末梢血中のBorrelia theileri。D.バーキットリンパ腫。

これは、実行するのが簡単な技術であり、非常に機能的で経済的であるため、現在、臨床検査室で血液塗抹標本、骨髄サンプル、組織切片のために広く使用されています。

ギムザ染色技術は、特定の細胞構造の観察を可能にするため、細胞学的研究に非常に役立ちます。この技術は、細胞質、核、核小体、液胞、および細胞の顆粒を染色し、微細な痕跡のクロマチンでも区別することができます。

さらに、核のサイズ、形状、または色の大きな変化を検出でき、核と細胞質の関係の喪失を視覚化できます。

一方、白血病などの重篤な疾患の診断に重要な骨髄や末梢血中の未熟細胞を特定することができます。とりわけ、血液寄生虫、細胞外および細胞内細菌、真菌を検出することも可能です。

細胞遺伝学では、細胞の有糸分裂を研究することが可能であるため、広く使用されています。

ギムザ染色の基礎

Romanowskyタイプの染料は、酸性染料と塩基性染料のコントラストを使用して、それぞれ塩基性構造と酸性構造の染色を実現します。見て分かるように、基本構造を染色するための酸性染料の親和性があり、逆もまた同様です。

使用される基本的な染料はメチレンブルーとその酸化誘導体（Azure AとAzure B）ですが、酸性染料はエオシンです。

細胞の酸構造は、とりわけ核酸、セグメント化された好塩基球の顆粒であるため、メチレンブルーで染色されます。

これと同じ意味で、細胞の基本的な構造はヘモグロビンと、とりわけ、セグメント化された好酸球に含まれるものなどのいくつかの顆粒です。これらはエオシンで染色されます。

一方、メチレンブルーとアズールは異染性の着色剤であることを特徴としているため、ポリアニオンの負荷に応じて、さまざまな構造にさまざまな色相を提供できます。

これは、塩基性染料と酸性染料の戦略的な組み合わせが、各構造の生化学的特性に従って、幅広い構造の色を開発する方法です。

エオシンによって提供される着色はより安定していますが、赤みがかったオレンジとサーモンの間で色を生成します。

材料

原液を調製するための材料

ストック溶液の調製には、500 mgのアセトンを含まないメチルアルコールと50 mlの中性グリセリンを測定して、粉末のギムザ染色剤を600 mg計量する必要があります。

ストック溶液を準備する方法

重いギムザ粉末を乳鉢に入れます。しこりがある場合は、スプレーする必要があります。続いて、かなりの量の測定したグリセリンを加え、よく混ぜます。得られた混合物を非常にきれいな褐色瓶に注ぐ。

残りのグリセリンは乳鉢に入れられます。乳鉢の壁に付着した残りの着色剤をきれいにするために再度混合し、同じ瓶に注ぎます。

ボトルに蓋をして、55℃のウォーターバスに2時間入れます。ウォーターバスに入った状態で、30分程度ごとにゆっくりと振ります。

続いて、混合物を冷ましてアルコールを入れる。以前は、測定されたアルコールの一部を乳鉢に入れて、残りの着色剤の洗浄を終了し、その後、残りのアルコールと一緒に混合物に加えていました。

この準備は、少なくとも2週間熟成させる必要があります。原液の使用済み部分はろ過する必要があります。

プレパレーションの汚染を避けるために、スポイトで小さな琥珀色のボトルに常に使用される予定の部分を移すことをお勧めします。試薬がなくなるたびに補充してください。

緩衝液を調製するための材料

一方、pH 7.2の緩衝液は以下のように調製します。

6.77 gのリン酸ナトリウム（無水）（NaHPO ₄）、2.59 gのリン酸二水素カリウム（KH ₂ PO ₄）、および蒸留水を1000 ccまで計量します。

着色剤の最終準備

最終染色液の調製のために、2 mlのろ過された原液が測定され、6 mlの緩衝液と混合されます。混合物をかき混ぜる。

考慮しなければならない関連する事実は、着色の準備技術が商業会社によって異なる場合があることです。

着色を実行するために必要な追加の材料

説明されている材料とは別に、カラーリングブリッジ、洗浄用の水またはバッファー付きのTシャツ、オブジェクトのスライドまたはカバー、着色時間を制御するためのストップウォッチ、乾燥に使用できる吸い取り紙または材料（ガーゼまたは綿）。

技術

染色工程

1）染色の前に、サンプルの塗抹標本を清潔なスライドに準備する必要があります。

サンプルは、血液、骨髄、組織学的組織切片、または子宮頸部膣サンプルです。スプレッドは薄く、着色する前に1〜2時間乾燥させることをお勧めします。

2）着色橋の上に、着色する必要のあるすべてのシートを置きます。あなたは常に同じ順序で作業し、各シートはよく識別されます。

3）スメアに数滴の100％メチルアルコール（メタノール）を置き、3〜5分間作用させて、サンプルを固定および脱水します。

4）シート上にあるメタノールを捨て、風乾させます。

5）乾燥したら、最終的な染色液をスポイトでシート全体が覆われるまで置きます。15分間行動に任せます。一部の著者は、25分までを推奨しています。事業所によります。

6）汚れを排出し、スミアを蒸留水または7.2緩衝液で洗浄します。

7）吸い取り紙の上で、サポートの助けを借りて縦に並べて、シートを戸外で乾燥させます。

8）スライドの裏側をアルコール綿棒または綿棒で拭き、汚れの跡をすべて取り除きます。

ユーティリティ

ギムザ染色技術は、血液学、真菌学、細菌学、寄生虫学、細胞学、細胞遺伝学など、さまざまな分野で使用されています。

血液学

それはこの汚れに与えられる最も頻繁な使用です。これにより、骨髄や末梢血のサンプルに存在する細胞のすべてを特定できます。各シリーズの数を推定するだけでなく、白血球増加症または白血球減少症、血小板減少症などを検出することができます。

それは未熟な細胞を識別するのに敏感であるため、それは急性または慢性白血病の診断に関連しています。とりわけ、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球などの貧血の診断を行うことも可能です。

菌学

この領域では、組織サンプルでHistoplasma capsulatum（細胞内二形性真菌）を検索するためにその使用が一般的です。

細菌学

ギムザで染色された血液塗抹標本では、再発熱と呼ばれる疾患を呈する患者でボレリア属菌を検出することが可能です。スピロヘータは、発熱のピーク時に採取されたサンプルで、赤血球の中に豊富です。

感染細胞内のリケッチアspやクラミジアトラコマチスなどの細胞内細菌を可視化することも可能です。

寄生虫学

寄生虫学の分野では、ギムザ染色により、マラリア、シャーガス病、リーシュマニア症などの寄生虫病の診断が可能になりました。

最初の2つでは、Plasmodium spとTrypanosoma cruziの寄生虫が感染した患者の末梢血にそれぞれ見られます。これらは、病気の病期に応じてさまざまな病期に見られます。

血液中の寄生虫の検索を改善するには、メイ・グリュンワルド染色と混合したギムザ染色を使用することをお勧めします。

同様に、皮膚リーシュマニア症は、寄生虫が見つかったギムザ染色された皮膚生検サンプルを評価することによって診断できます。

細胞学

ギムザ染色は子宮頸部サンプルの細胞学的研究にも使用されますが、この目的で最も頻繁に使用される手法ではありません。

ただし、リソースが不足している場合は使用でき、パパニコローの手法と同様の機能を低コストで提供できます。ただし、審査官側の専門知識が必要です。

細胞遺伝学

ギムザ染色に関連する機能は、DNAのアデニンおよびチミンに富む領域に強く結合する能力です。これにより、細胞の有糸分裂中にさまざまな凝縮状態でDNAを視覚化できます。

これらの研究は、染色体の異なる領域の重複、欠失、転座などの色収差を検出するために必要です。

ギムザ染色の有効性を示す研究

Cannova et al（2016）は、皮膚リーシュマニア症の診断のために3つの染色技術を比較しました。

このために、彼らは実験的にリーシュマニアを接種された実験動物（Mesocrisetus auratus）から得られたサンプルを使用しました。

著者らは、ギムザ染色がPap-mart®およびガフニー染色よりも優れていることを示しました。したがって、彼らはギムザ染色が皮膚リーシュマニア症の診断に理想的であると考えました。

著者によって得られた優れた結果は、ギムザ混合物を構成する色素の組み合わせが好ましいコントラストを生み出すために必要な条件を提示し、細胞内および細胞外の両方で無鞭毛型の構造を明確に区別できるようにするという事実によるものです。

他の手法（Pap-mart®とGaffney）もそれを行いましたが、方法がより弱いため、視覚化することがより困難です。ギムザ染色がリーシュマニア症の寄生虫診断に推奨されるのはそのためです。

同様に、Ramirez et al（1994）による研究では、クラミジアトラコマチスの同定のための結膜塗抹標本におけるギムザとレンドラム染色の有効性を評価しました。

著者はギムザとレドラムの染色は等しい特異性を有すると決定したが、ギムザはより敏感であることがわかった。

これは、特にリソースが少ない場合は特に、ギムザ染色がクラミジア感染症の診断に現在最も頻繁に使用されている理由を説明しています。

出典：PanReac Applichem ITW Reagents。ギムザ染色。バージョン2：JMBJUL17 CEIVD10ES。カステリャデルバレス、スペイン。

良好な染色に関する推奨事項

シートの乾燥は加速しないでください。戸外で乾かすには、妥当な時間が必要です。約2時間。

最良の結果を得るために、2時間後すぐに色を塗ってください。

塗抹標本を固定してよりよく染色するには、薄く均一な層が残るようにサンプルをスライドに分配する必要があります。

塗抹標本は一滴の血液から直接作られ、したがってサンプルには添加物が含まれておらず、細胞構造の維持に有利であるため、好ましい血液サンプルは毛細血管です。

ただし、静脈血を使用する場合、ヘパリンは通常細胞を変形させるため、EDTAを抗凝固剤として使用し、ヘパリンとしては使用しないでください。

ギムザ染色の一般的な間違い

このカラーリングの練習では間違いをすることができます。それらは、構造の色調の突然の変化によって証明されます。

非常に青い着色

次の原因が考えられます：

• 非常に厚い汚れ
• 染色時間の超過
• 洗浄が不十分です。
• 中性（アルカリ性）pHをはるかに超える試薬の使用。

これらの条件下では、次の構造の色が歪んでいます。これにより、サーモンピンクを染色する代わりに赤血球が緑色に見え、赤く塗らなければならない好酸球の顆粒が青みがかったまたは灰色に変わります。通常のトーンの偏差。

過度にピンクの着色

次の原因が考えられます：

• 染色時間が不十分です。
• 長時間または過度の洗浄。
• 乾燥不良。
• 高酸性試薬の使用。

この特定のケースでは、通常青く染まる構造はほとんど見えませんが、ピンクに染まる構造は色を非常に誇張します。

例：赤血球は明るい赤または明るいオレンジに変わり、核クロマチンは淡いピンクに見え、好酸球の顆粒は濃い明るい赤に染まります。

塗抹標本における沈殿物の存在

原因は次のとおりです。

• 汚れた、または汚れたフィルムを使用してください。
• 塗抹標本を十分に乾燥させないでください。
• 定着液を長時間放置します。
• 染色終了時の洗浄が不十分です。
• 使用されている着色剤の濾過が不十分または濾過されていない。

形態学的アーティファクトの存在

形態学的アーティファクトが塗抹標本に表示され、存在する構造の視覚化と解釈が困難になる場合があります。これは、に起因するものです：

• ヘパリンなどの使用される抗凝固剤の種類。
• 汚れた、劣化した、または油っぽいフィルムの使用。

ストレージモード

調製後、色素が沈殿しないように、色素は室温（15〜25°C）で保管する必要があります。密に閉じた琥珀色の容器に保管する必要があります。

参考文献

1. Cannova D、Brito E、SimonsM。皮膚リーシュマニア症の診断のための染色技術の評価。サルス。2016; 20（2）：24-29。
2. PanReac Applichem ITW試薬。ギムザ染色。バージョン2：JMBJUL17 CEIVD10ES。カステリャデルバレス、スペイン。
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4. 応用臨床化学。インビトロ診断のためのギムザ染色。ディストリビューター：cromakit.es
5. ラミレスI、メヒアM、ガルシアデラリバJ、ヘルメスF、グラツィオソC.クラミジアトラコマチスの同定のための結膜塗抹標本におけるギムザとレンドラム染色の妥当性。Sanit PanamのBol。1994; 116（3）：212-216。
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7. 「ギムザの染み」ウィキペディア、フリー百科事典。2017年9月1日、01：02 UTC。2018年12月6日、es.wikipedia.org。